余曉明，袁雪凌，孟昊業(yè)，孫 振，尹合勇，郭全義，彭 江，汪愛(ài)媛，盧世璧解放軍總醫(yī)院 骨科研究所，北京 00853；南開(kāi)大學(xué)，天津 30007

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種臨床上常見(jiàn)的退行性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的退行性改變、關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)困難、骨贅形成等癥狀，好發(fā)于中老年人[1-2]。MicroRNAs(miRNAs，miR)是一個(gè)龐大的內(nèi)源性、非編碼核苷酸序列家族，長(zhǎng)度21 ~ 25個(gè)核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后信使RNA的功能上調(diào)控基因的表達(dá)[3-5]。近年來(lái)，越來(lái)越多的miRNAs被證明在骨科疾病中起著重要作用[6]。而miRNA-214被證明在骨質(zhì)疏松的骨重塑過(guò)程中對(duì)破骨細(xì)胞的功能有調(diào)控作用[7]。為進(jìn)一步研究miR-214的功能，本實(shí)驗(yàn)旨在探究其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程中的表達(dá)情況，以便了解miR-214作為骨性關(guān)節(jié)炎治療靶向標(biāo)記物的潛在價(jià)值。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)用原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者及截肢患者脛骨平臺(tái)標(biāo)本，由本院關(guān)節(jié)外科行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療的30例OA患者及嚴(yán)重創(chuàng)傷需行截肢手術(shù)治療的10例患者自愿捐贈(zèng)。均排除腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、感染及激素治療等因素。其中男性23例，女性17例，年齡31 ~ 82歲?；颊咝g(shù)前均行雙膝關(guān)節(jié)負(fù)重位X線檢查，后依據(jù)Kellgren-Lawrence X線診斷標(biāo)準(zhǔn)將其分為Ⅰ級(jí)組(10例)、Ⅱ級(jí)組(10例)、Ⅲ級(jí)組(10例)、Ⅳ級(jí)組(10例)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2 RNA提取 將收集的脛骨平臺(tái)分離軟骨和軟骨下骨，用陶瓷研缽分別將其在液氮下研碎。將分離的軟骨及軟骨下骨100 mg分別裝入1.5 ml EP管中，用TRIzol提取組織中的RNA，樣本經(jīng)裂解、分層、RNA沉淀、洗滌和溶解后，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，確保后續(xù)試驗(yàn)準(zhǔn)確度。

3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SYBR Green ReverTra Ace qPCR RT Kit)說(shuō)明書(shū)中要求，配置20μl反應(yīng)體系，將測(cè)定濃度后的RNA樣本加入反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行，配置反轉(zhuǎn)錄體系反應(yīng)液的所有操作均在冰上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系成分：5×RT Buffer，4μl；RT Enzyme Mix，1μl；Primer Mix，1μl；RNA sample，2μl；Nuclear free water，加至20μl。反應(yīng)條件 ：37℃15 min，95℃5 min。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)miR-214：按照qPCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus)說(shuō)明書(shū)中要求，配置擴(kuò)增反應(yīng)混合液，并分別加入miR-214引物，U6為內(nèi)參引物，最后加入反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，反應(yīng)體系成分：SYBR Green RT-PCR Master Mix，10μl；Plus solution，2μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；cDNA，1μl；Nuclear free water，6μl。引物序列：miR-214，上游為GACAGCAGGCACAGACA，下游為GT GCAGGGTCCGAGG；U6上游為CTCGCTTCGGCAG CACA3，下游為AACGCTTCACGAATTTGCGT。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s，中間兩步共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系在實(shí)時(shí)熒光定量PCR機(jī)(Applied Biosystems Life Technologies，F(xiàn)oster City，CA，USA)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在結(jié)果分析中，miRNAs與U6的相對(duì)表達(dá)量用Delta Ct(ΔCt)表示，其最后表達(dá)倍數(shù)值用2-ΔΔCt值表示。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，各組間作比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-214在OA軟骨組織中的表達(dá)水平 所有樣本中均有miR-214表達(dá)，Ⅳ級(jí)組中miR-214的表達(dá)水平最高，各組表達(dá)水平呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)(圖1)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。OA發(fā)展嚴(yán)重程度與miR-214的表達(dá)水平呈正相關(guān)。

2 miR-214在OA軟骨下骨中的表達(dá)水平 Ⅲ級(jí)組中miR-214的表達(dá)水平明顯高于其他3組(P＜0.05)。軟骨下骨中miR-214的表達(dá)水平差異不同于軟骨中表達(dá)水平。見(jiàn)圖2。

圖 1 不同OA分級(jí)組軟骨中miR-214的表達(dá)情況(aP＜0.05)Fig. 1 Expression level of miR-214 in different grade of OA cartilage(aP＜0.05)

圖 2 不同OA分級(jí)組軟骨下骨中miR-214的表達(dá)情況(aP＜0.05)Fig. 2 Expression level of miR-214 in different grade of OA subchondral bone (aP＜0.05)

討 論

骨性關(guān)節(jié)炎主要以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨進(jìn)行性改變、骨贅形成和滑膜炎癥反應(yīng)為主要特征，嚴(yán)重影響著患者的日常生活質(zhì)量，而目前為止，最有效的治療方法只是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)[8-9]。雖然OA為中老年人最常見(jiàn)關(guān)節(jié)疾病，但發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確。如今，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制已成為越來(lái)越多學(xué)者的研究熱點(diǎn)[10]。探索骨關(guān)節(jié)炎的更加有效的治療方法也成為分子生物領(lǐng)域的重點(diǎn)。

miRNAs主要起調(diào)控基因表達(dá)的作用，在關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展中有很重要的作用[11]。miR-146a已被發(fā)現(xiàn)在OA軟骨中早期高表達(dá)，晚期低表達(dá)，并且其表達(dá)減少是由白介素-1β導(dǎo)致[12]。miR-140亦被證明在OA軟骨中被白介素-1β調(diào)控而表達(dá)降低，從而引起異?；虻谋磉_(dá)，且miR-140還參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的修復(fù)及骨發(fā)育等過(guò)程，對(duì)軟骨及骨的修復(fù)和發(fā)育具有關(guān)鍵作用[13-14]?；趍iRNAs在骨和軟骨中復(fù)雜的功能，miRNAs被認(rèn)為是一種新型、高效能的調(diào)節(jié)OA中基因表達(dá)的方法[15]。

在miRNAs在骨和軟骨組織中的調(diào)控功能的研究中，miR-214已被發(fā)現(xiàn)是一種新型的調(diào)控成骨轉(zhuǎn)化的因子，抑制了小鼠成肌細(xì)胞的成骨分化功能[16]；而在成骨細(xì)胞中，miR-214通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞的活性及基質(zhì)礦化過(guò)程，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[7]。然而在骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究中，miR-214的功能尚未明確。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，作者證實(shí)了miR-214在OA軟骨及軟骨下骨中的異常表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)，在軟骨中miR-214的表達(dá)水平隨著OA嚴(yán)重程度的增加而逐漸升高，由此可見(jiàn)，miR-214可能參與OA進(jìn)程中軟骨損傷的過(guò)程，通過(guò)調(diào)控軟骨相關(guān)退化基因而加速軟骨的退化。而在OA的發(fā)展過(guò)程中，軟骨和軟骨下骨可以構(gòu)成復(fù)合單元，在結(jié)構(gòu)和功能上相互影響[2,17-19]。日?；顒?dòng)中，關(guān)節(jié)受到過(guò)度力學(xué)負(fù)荷而引發(fā)骨重塑，由早期的骨質(zhì)吸收到晚期的骨質(zhì)增生，再到最終的晚期骨質(zhì)硬化和骨贅形成，整個(gè)OA病程中都存在骨重塑。而miR-214在軟骨下骨中的異常表達(dá)，說(shuō)明miR-214可能在骨重塑中起重要作用，而在K-L分級(jí)的Ⅲ級(jí)組中表達(dá)最高，證明隨著骨質(zhì)吸收的增加，miR-214的表達(dá)水平逐漸升高，而晚期骨質(zhì)增生、骨贅形成，miR-214表達(dá)下降，由此表明，miR-214可能通過(guò)調(diào)控成破骨細(xì)胞活性而調(diào)節(jié)骨重塑過(guò)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-214在OA的發(fā)病過(guò)程中有重要作用，在軟骨退變及軟骨下骨改變中可能調(diào)控重要基因的表達(dá)，參與軟骨退化及骨重塑。為下一步對(duì)miR-214在OA中的調(diào)控機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。通過(guò)后期深入研究miR-214在軟骨退變中的調(diào)控機(jī)制，結(jié)合其在骨中的調(diào)控功能，將為OA的臨床診斷和治療提供一種新型、有效的思路和方式。

1 Loeser RF， Goldring SR， Scanzello CR， et al. Osteoarthritis： a disease of the joint as an organ［J］. Arthritis Rheum， 2012， 64（6）：1697-1707.

2 Burr DB， Gallant MA. Bone remodelling in osteoarthritis［J］. Nat Rev Rheumatol， 2012， 8（11）：665-673.

3 Lu J， Getz G， Miska EA， et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］. Nature， 2005， 435（743）： 834-838.

4 Kosaka N， Iguchi H， Ochiya T. Circulating microRNA in body fluid：a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis［J］.Cancer Sci， 2010， 101（10）： 2087-2092.

5 Kobayashi T， Lu J， Cobb BS， et al. Dicer-dependent pathways regulate chondrocyte proliferation and differentiation［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2008， 105（6）： 1949-1954.

6 吳國(guó)棟，馬寧，高旭．MicroRNA——關(guān)節(jié)炎治療的新靶點(diǎn)［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28（10）：888-891．

7 Wang X， Guo B， Li Q， et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation［J］. Nat Med， 2013， 19（1）： 93-100.

8 Berenbaum F. Osteoarthritis as an inflammatory disease （osteoarthritis is not osteoarthrosis!）［J］. Osteoarthritis Cartilage， 2013， 21（1）：16-21.

9 安曉，張琦，龔科，等．骨性關(guān)節(jié)炎與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者單側(cè)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后圍術(shù)期效果比較［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（10）：1022-1024．

10 周博，朱劍，李坤鵬，等．超聲下關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)積液分布特點(diǎn)［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（7）：719-721．

11 Nakasa T， Nagata Y， Yamasaki K， et al. A mini-review： microRNA in arthritis［J］. Physiol Genomics， 2011， 43（10）：566-570.

12 Yamasaki K， Nakasa T， Miyaki S， et al. Expression of MicroRNA-146a in osteoarthritis cartilage［J］. Arthritis Rheum， 2009， 60（4）：1035-1041.

13 Miyaki S， Nakasa T， Otsuki S， et al. MicroRNA-140 is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-1 responses［J］. Arthritis Rheum， 2009， 60（9）：2723-2730.

14 趙振國(guó)．miRNA-140在骨性關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展［J］．安徽醫(yī)藥，2012，16（8）：1053-1055．

15 Miyaki S， Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis［J］. Nat Rev Rheumatol， 2012， 8（9）： 543-552.

16 Shi K， Lu J， Zhao Y， et al. MicroRNA-214 suppresses osteogenic differentiation of C2C12 myoblast cells by targeting Osterix［J］.Bone， 2013， 55（2）： 487-494.

17 袁雪凌，孟昊業(yè)，王永成，等．膝關(guān)節(jié)原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎軟骨-軟骨下骨復(fù)合單元改變的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2014，22（9）：819-825．

18 王永成，孟昊業(yè)，袁雪凌，等．兔骨軟骨缺損自發(fā)性修復(fù)模型中軟骨下骨重塑與軟骨再生的關(guān)系［J］ .中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2014，28（6）：681-686．

19 Lories RJ， Luyten FP. The bone-cartilage unit in osteoarthritis［J］.Nat Rev Rheumatol， 2011， 7（1）： 43-49.