徐鳴皋,丁進(jìn)亞,徐 娟，孫 潔

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430070)

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WalkAway 40誤鑒定布魯菌1例

徐鳴皋,丁進(jìn)亞,徐 娟，孫 潔

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430070)

布魯菌； 16S rRNA； 誤鑒定

布魯菌被列為B類生物恐怖戰(zhàn)劑，同時(shí)也是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室獲得性感染的重要病原菌。因此實(shí)驗(yàn)室能夠準(zhǔn)確、快速、安全的鑒定這種病原菌就顯得至關(guān)重要。從患者血液、骨髓、其他體液及排泄物等任一培養(yǎng)物中分離出布魯菌即可確診為布魯菌病。目前臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的全自動(dòng)血液培養(yǎng)系統(tǒng)如BACTEC和BacT/ALERT已經(jīng)顯著提高了從標(biāo)本中分離出布魯菌的速率[1-2]。但是在使用自動(dòng)化的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的過程中，布魯菌的誤鑒定一直都存在。本院從1例不明原因發(fā)熱患者血液和骨髓中分離出1株緩慢生長(zhǎng)細(xì)菌，由WalkAway 40鑒定為動(dòng)物潰瘍威克斯菌、莫拉菌屬等，而Vitek2 Compact和16S rRNA 基因序列檢測(cè)鑒定為布魯菌。

1 臨床資料

1.1 一般資料 患者,男性，17歲。入院20 d前于體能訓(xùn)練后出現(xiàn)咽痛，繼而出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱，體溫最高達(dá)40.1 ℃?；颊甙l(fā)熱時(shí)感頭痛，咽痛，熱退后無特殊不適感，無大汗淋漓，無全身關(guān)節(jié)疼痛。曾在單位衛(wèi)生隊(duì)給予退熱處理，體溫下降后又復(fù)升，且咽痛程度加重，吞咽時(shí)尤甚，遂來本院就診。本院門診查血常規(guī)、肺部X線片正常，雙側(cè)扁桃體Ⅱ度腫大，可見白色豆渣樣分泌物，以“急性扁桃體炎”收入感染內(nèi)科。入院時(shí)患者否認(rèn)近期禽類接觸史，否認(rèn)密切接觸人群有類似癥狀。入科后查白細(xì)胞介素-6 26.0 pg/mL；抗“O”315.00 U/mL↑、C反應(yīng)蛋白12.40 mg/L↑，考慮“化膿性扁桃體炎”可能性較大。依次使用過哌拉西林鈉舒巴坦鈉、克林霉素、左旋氧氟沙星等，因患者持續(xù)高熱不退一度將抗菌藥物調(diào)整為替考拉寧?；颊呷肟坪蠹葱醒号囵B(yǎng)和骨髓培養(yǎng)，血液與骨髓經(jīng)BacT/Alert 3D240培養(yǎng)48 h報(bào)陽性，轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，經(jīng)2 d培養(yǎng)形成針尖樣細(xì)小菌落，革蘭染色呈紅色短小桿菌，氧化酶陽性，動(dòng)力陰性。取血瓊脂平板上菌落分別使用WalkAway 40和Vitek2 Compact鑒定。WalkAway 40 NC31鑒定藥敏復(fù)合板將血液中分離株鑒定為動(dòng)物潰瘍威克斯菌(74.18%)、洛菲不動(dòng)桿菌(23.37%)；將骨髓分離株鑒定為莫拉菌屬(40.14%)、動(dòng)物潰瘍威克斯菌(21.86%)等。而Vitek2 Compact GN鑒定卡將血液和骨髓中分離株均鑒定為馬耳他布魯菌(99%、98%)。因兩種細(xì)菌鑒定系統(tǒng)結(jié)果不一致，將菌株送至軍事科學(xué)院復(fù)檢。因患者入院時(shí)正值重點(diǎn)防控禽流感時(shí)期，接觸史中僅明確無禽類接觸史，立刻詢問患者是否有牛羊接觸史，患者否認(rèn)?；颊咴谑褂锰婵祭瓕幒篌w溫逐漸降低，目前體溫正常。臨床因報(bào)告疑似布魯菌，將抗菌藥物更改為米諾環(huán)素+利福平，但更改抗菌藥物后患者體溫持續(xù)升高，最高達(dá)40.4 ℃。后軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院回報(bào)經(jīng)16S rRNA基因檢測(cè)確證為布魯菌。同時(shí)患者回憶起曾于1個(gè)月前清掃羊圈，誤將羊糞吸入口鼻，1周后出現(xiàn)發(fā)熱癥狀。在接觸史和病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果明確后確診為布魯菌病，抗菌藥物更改為利福平膠囊+多西環(huán)素+復(fù)方磺胺甲噁唑片，3 d后患者體溫峰值出現(xiàn)下降趨勢(shì)，最高體溫降至37.8 ℃，5 d后體溫完全正常，未再反復(fù)。在患者確診為布魯菌病后，患者單位追查羊只去向，查得部分羊只已死亡，并被掩埋，剩余羊只均未檢出布魯菌，也未有新的病例發(fā)生。

1.2 標(biāo)本來源 2013年廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院一名發(fā)熱患者的血液和骨髓。

1.3 儀器及試劑 BACT/ALERT 3D240血培養(yǎng)儀，質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌(ATCC 27853)；西門子Walkaway 40(軟件版本V3.0)，NC31鑒定藥敏復(fù)合板(批號(hào)20120922)，質(zhì)控菌株：大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)；梅里埃Vitek2 Compact(軟件版本5.04),GN鑒定卡 (批號(hào)241254040)，質(zhì)控菌株：嗜麥芽窄食單胞菌(ATCC 17666)。

1.4 菌株分離培養(yǎng) 取陽性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液三區(qū)劃線接種于血瓊脂平板，分別置于35 ℃孵箱和5%CO2孵箱孵育，每日觀察平板生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài)。

1.5 16S rRNA基因檢測(cè) 送至軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院進(jìn)行基因測(cè)序。

2 討 論

布魯菌被誤鑒定為動(dòng)物潰瘍威克斯菌或其他細(xì)菌是非常危險(xiǎn)的。(1)誤鑒定會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室工作人員無法采取正確的防護(hù)措施。世界衛(wèi)生組織將布魯菌列為危險(xiǎn)度3級(jí)的病原微生物，最低防護(hù)要求至少在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中使用Ⅱ級(jí)生物安全柜進(jìn)行相關(guān)操作。而WalkAway 40的鑒定藥敏復(fù)合板為開放型，檢測(cè)孔均裸露在外且必須使用手工加樣、上板、下板。其上板、下板等操作無法在生物安全柜中完成，在病原菌不明的情況下大大增加了工作人員被感染的概率。相對(duì)而言，Vitek2 Compact使用的鑒定卡完全密封，并且采用全自動(dòng)封閉真空加注系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)行鑒定卡的進(jìn)樣、封口、上卡、退卡，安全性明顯高于WalkAway 40。(2)該患者入院初期相關(guān)接觸史不明確，起病過程不典型，呈持續(xù)發(fā)熱表現(xiàn)，而非典型的波浪熱，也未有關(guān)節(jié)疼痛等相關(guān)癥狀，從而增加了臨床診斷的難度，如果誤鑒定為動(dòng)物潰瘍威克斯菌或莫拉菌屬等，則錯(cuò)誤的診斷和病情的延誤將難以避免，這會(huì)使患者經(jīng)歷錯(cuò)誤的抗菌藥物治療，失去早期治療的最佳時(shí)機(jī)而發(fā)展為慢性全身性感染[3]。(3)如不能及時(shí)處理患有布魯菌病的羊只，流入市場(chǎng)或?qū)⒉剪斁鷤魅窘o其他羊只或密切接觸人群，導(dǎo)致布魯菌病爆發(fā)。

自動(dòng)化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)布魯菌的誤鑒定已有相關(guān)報(bào)道，分析原因可能有如下幾點(diǎn):布魯菌的生化反應(yīng)不活潑,鑒定系統(tǒng)缺乏布魯菌的相關(guān)數(shù)據(jù)庫，缺少對(duì)應(yīng)的鑒定卡，加樣讀數(shù)等因素導(dǎo)致某些生化反應(yīng)速度產(chǎn)生差異等。雖然Vitek2 Compact鑒定布魯菌的文獻(xiàn)報(bào)道很多，但亦有誤鑒定的報(bào)道。楊婧等[4]報(bào)道2011～2012年有3株布魯菌在首次鑒定中被誤鑒定為支氣管敗血鮑特菌(1株)和人蒼白桿菌(2株)，而在第2次鑒定中均鑒定為布魯菌。基于生化方法的不確定性，越來越多的實(shí)驗(yàn)室使用分子生物學(xué)方法來鑒定布魯菌。目前，通過16S rRNA 的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增及其產(chǎn)物測(cè)序，可以進(jìn)行快速診斷，能夠區(qū)分不同種源的布魯菌，可用于布魯菌種屬的快速鑒定和流行病學(xué)調(diào)查，具有良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性[5-6]。

布魯菌病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸比較復(fù)雜，其臨床表現(xiàn)往往不典型，很難以一種癥狀來確診，易引起漏診、誤診[7]。對(duì)布魯菌病的診斷需結(jié)合接觸史、臨床表現(xiàn)和病原學(xué)檢查來做出綜合判斷。特別是在非布魯菌病流行區(qū)，在缺乏明顯的流行病學(xué)接觸史，沒有典型的臨床表現(xiàn)時(shí)，病原學(xué)檢查就顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)加強(qiáng)和臨床醫(yī)生的溝通，對(duì)和動(dòng)物有密切接觸史的患者應(yīng)高度重視布魯菌的檢出。如果該病因延誤治療而進(jìn)入慢性期，會(huì)對(duì)患者造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，甚至可能造成終身殘疾。基于自動(dòng)化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)易出現(xiàn)誤鑒定的情況，使用這類系統(tǒng)檢出動(dòng)物潰瘍威克斯菌、支氣管敗血鮑特菌、人蒼白桿菌等罕見細(xì)菌時(shí)，應(yīng)該使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行確證，降低布魯菌被誤鑒定成其他細(xì)菌的可能性。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.065

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1672-9455(2015)04-0575-02

2014-05-11

2014-09-18)