趙印泉　張啟翔

摘要：以梅花的花朵為材料，采用RT-PCR與RACE相結(jié)合的方法，從“三輪玉蝶”梅花的花朵中克隆到1個(gè)全長1 322 bp的氧-甲基轉(zhuǎn)移酶cDNA，命名為PmOMT，該基因編碼377個(gè)氨基酸的開放性閱讀框，具有植物氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因典型的3個(gè)保守基序，與月季（R. chinensis var. spontanea）的甲基（異）丁香酚轉(zhuǎn)移酶基因RcOMT1具有較高的同源性。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果表明，PmOMT與RcOMT1親緣關(guān)系最近，同屬COMTs類基因。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，PmOMT基因的相對(duì)表達(dá)量與甲基丁香酚色譜峰面積的變化趨勢相似，推測該基因可能參與甲基丁子香酚的生物合成。

關(guān)鍵詞：梅花；氧-甲基轉(zhuǎn)移酶；基因克?。黄鞴?；丁子香酚

中圖分類號(hào)： S685.170.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0022-04

梅花（Prunus mume）是我國的傳統(tǒng)名花，具有怡人香氣，釋放大量包括（異）丁香酚和甲基（異）丁香酚在內(nèi)的苯基/苯丙烷類芳香族化合物[1]，這些芳香族化合物是植物花香的重要成分，并作為信號(hào)因子引誘蛾類完成授粉[2]。氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferases，OMTs）是植物酚類衍生物形成過程中重要的一類酶，會(huì)將腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-l-methionine）的甲基轉(zhuǎn)移到酚類化合物的羥基上，形成類黃酮化合物、木質(zhì)素和花香化合物等3類酚類衍生物[3-5]，這些酚類衍生物在植物生長發(fā)育以及與環(huán)境的信息交流方面發(fā)揮著重要作用。本研究在前期梅花花香成分研究的基礎(chǔ)上，以“三輪玉蝶”梅花的花朵為材料，對(duì)梅花氧-甲基轉(zhuǎn)移酶全長基因進(jìn)行克隆，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在梅花不同器官中的表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究梅花花香基因功能及其形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

三輪玉蝶梅花種植于北京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，取梅花開花指數(shù)2～3級(jí)的花朵[1]、根、莖、葉片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花萼，用錫箔紙包好，液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱，備用。RNA Easy Kit試劑盒，購自北京蓋寧公司；普通cDNA第一鏈的合成試劑盒，購自MBI公司；pGM-T克隆試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，均購自北京天根生物公司；Go Taq Flexi DNA Polymerase、Pfu DNA Polymerase、DNaseⅠ，購自Promega公司；3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，購自TaKaRa公司；擴(kuò)增引物，由北京奧科生物公司合成；SYBR Green I 染料，Invitrogen公司生產(chǎn)；分析純級(jí)的其他試劑，均為國產(chǎn)。用于提取RNA的溶液，均用0.1% DEPC處理的水配制；離心管、槍頭等塑料制品，均用0.1% DEPC浸泡過夜，高壓滅菌，備用。

1.2 梅花PmOMT基因cDNA全長的獲得

按照RNA Easy spin kit試劑盒的說明提取花朵總RNA，用DNase Ⅰ酶去除RNA中的痕量DNA；用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA；根據(jù)GenBank中檢索到的仙女扇（異）甲基丁香酚（登錄號(hào)：U86760）和月季花氧位甲基轉(zhuǎn)移酶基因（登錄號(hào)：AB086103）核苷酸和氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)1對(duì)兼并引物為OMT1：5′-STTGTKGATGTTGGGGGBGGGCTAGG-3′和OMT2：5′ -ACAACWATBACYTTBCCATTRTCVGG-3′，以cDNA第一鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)獲得的保守序列，設(shè)計(jì)3′-RACE特異引物為OMT3：5′-AGGGTATCAATTTCGACTTGCC-3′，按3′-Full RACE Core Set Ver.2.0說明書進(jìn)行操作，獲得3′端序列；將保守區(qū)序列和3′-RACE序列進(jìn)行拼接，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書設(shè)計(jì)2個(gè)特異引物為OMT4：5′-GCTTTAGGCAGTGCTCATCGCTC-3′和OMT5：5′-CACTCCAGGATAGGAAGGGGCAT-3′，分別與試劑盒中的引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得5′端序列；所有擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，連接pGM-T載體，轉(zhuǎn)化Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，送北京奧科公司進(jìn)行測序。根據(jù)3′端和5′端拼接序列設(shè)計(jì)2條特異引物為OMT6：5′-GAACGTAAACATAGACAGTCCA-3′和OMT7：5′-AGTGTGTAAGTTTTCATATGCCT-3′，PCR擴(kuò)增、克隆、測序，獲得梅花氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長編碼序列。將測序得到的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別在NCBI上用Blast軟件進(jìn)行同源性檢索，序列拼接、分析和同源性比較用DNAMAN軟件完成；采用Mega 4.0軟件構(gòu)建植物OMTs類似基因蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 熒光定量PCR表達(dá)分析

通過Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）軟件獲得與OMTs基因的相似序列，在基因的編碼序列中跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)2條OMTs基因特異引物分別為OMT8：5′-TTCCCTCCCGGATTTTGAG-3′和OMT9：5′-TCGACTTGCCCCATGTTGTA-3′，目標(biāo)片段為294 bp；以GAPDH作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物GAPDH gsp1：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3和GAPDH gsp2：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，目標(biāo)片段為 440 bp。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠檢測和測序，進(jìn)一步驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)的特異性，同時(shí)根據(jù)CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偭繛?0 μL 的熒光PCR反應(yīng)體系為：H2O 12.1 μL；10 pmol/L上游引物 0.2 μL，10 pmol/L 下游引物0.2 μL；20×SYBR染料05 μL；2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL；25 mmol/L MgCl2 24 μL；10×buffer 2.0 μL，5 U/μL Taq酶 0.2 μL，模板 2.0 μL。利用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 120 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃讀取熒光值；循環(huán)結(jié)束，60 ℃保溫60 s，進(jìn)行熔解曲線分析，檢測每份樣品的OMTs基因和內(nèi)參基因CT值。每份樣品重復(fù)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算定量結(jié)果平均值、校正值、標(biāo)準(zhǔn)差，使用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花PmOMT基因cDNA全長的獲得及序列分析

結(jié)果表明，以梅花的花朵cDNA為模板，OMT1、OMT2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1個(gè)300 bp大小的片段，經(jīng)Blast比對(duì)，該片段與其他植物OMTs基因有較高的同源性；3′-RACE獲得含Poly（A）尾大小為581 bp的3′端序列，5′-RACE獲得1個(gè)829 bp的5′端序列；用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物PCP擴(kuò)增，最終獲得1條長為1 322 bp的基因全長cDNA序列，GenBank登錄號(hào)為GU339212，命名為PmOMT，該基因完整的開放閱讀框長1 134 bp，編碼377個(gè)氨基酸（圖1），5′端非編碼區(qū)長23 bp，3′端非編碼區(qū)長 165 bp。

2.2 PmOMT編碼氨基酸的同源性分析

由圖2可見，PmOMT基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氧-甲基轉(zhuǎn)移酶具有較高的同源性，其中，與催化形成甲基（異）丁香酚的月季花氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因RcOMT1、RcOMT3同源性分別為67.6%、67.8%；PmOMT具有植物OMTs典型的3個(gè)保守基序。

2.3 PmOMT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

由圖3可見，OMT基因編碼的氨基酸序列明顯分為2個(gè)類群，COMTs是氧-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白序列，OMTs是類黃酮蛋白序列；PmOMT與RcOMT1遺傳距離相對(duì)最近，同屬氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因類。

2.4 PmOMT在梅花不同組織中的特異性表達(dá)

以GAPDH基因作為內(nèi)參照，采用熒光定量PCR 方法對(duì)梅花不同組織中PmOMT的表達(dá)進(jìn)行檢測。由圖4可見，PmOMT基因在所有組織均有表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為雄蕊、花瓣、雌蕊、萼片、葉片、莖、根，生殖器官組織的PmOMT基因相對(duì)表達(dá)量高于營養(yǎng)器官組織。

3 結(jié)論與討論

從梅花的花朵中克隆得到的PmOMT基因具有植物OMTs基因典型的3個(gè)保守基序，與大多數(shù)植物的OMTs基因具有較高的同源性，其中，與同屬薔薇科的月季花甲基（異）丁香酚氧-甲基轉(zhuǎn)移酶RcOMT1和未知功能的RcOMT3基因同源性相對(duì)最高。將PmOMT與部分已知功能的植物OMTs作氨基酸序列分子進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，PmOMT屬于咖啡酸氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMTs）1類，且在選取的梅花組織中均有表達(dá)。有研究表明，COMTs亞家族基因?qū)Ρ江h(huán)上含有2個(gè)鄰位羥基的底物具有優(yōu)先催化的特性，香草蘭（Vanilla planifolia）COMTs基因優(yōu)先以3，4-二羥基-苯甲醛為底物形成香草

醛[6]，以3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛為底物形成丁香醛[7]，這種特性在金腰屬（Chrysosplenium americanum）、楊樹（Populus deltoids）、月季花、草莓（Fragaria×ananassa）等植物[8-11]上都有表現(xiàn)。

梅花PmOMT基因參照月季花RcOMT1基因采用同源克隆法克隆，與RcOMT1具有最高的同源性和親緣關(guān)系，且PmOMT基因在三輪玉蝶梅生殖器官的表達(dá)量高于營養(yǎng)器官。（異）丁香酚和甲基（異）丁香酚都是梅花的花香產(chǎn)物，（異）丁香酚在苯基上含有2個(gè)鄰位羥基，鑒于COMTs亞家族基因?qū)Ρ江h(huán)上含有2個(gè)鄰位羥基的底物具有優(yōu)先催化的特性，因此初步認(rèn)為PmOMT基因?qū)儆贑OMTs基因，但是否能直接決定花香的形成仍須進(jìn)一步探究。

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