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摘要：為了研究妊娠母犬和空懷母犬的血常規(guī)，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定了20只妊娠母犬及20只空懷母犬血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的數(shù)量，并進(jìn)行了鑒別。結(jié)果表明：妊娠母犬血液中紅細(xì)胞、血小板的數(shù)量顯著低于空懷母犬，白細(xì)胞數(shù)量極顯著高于空懷母犬。經(jīng)過臨床應(yīng)用測(cè)試，證實(shí)試驗(yàn)結(jié)論可作為母犬妊娠早期診斷的重要參考指標(biāo)并可應(yīng)用于臨床。

關(guān)鍵詞：母犬；妊娠診斷；血常規(guī)；臨床應(yīng)用

中圖分類號(hào)： S858.292.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0206-03

收稿日期：2014-03-04

基金項(xiàng)目：河南省商丘市科技計(jì)劃（編號(hào)：20112027）。

作者簡(jiǎn)介：郭全海（1980—），男，河南淮陽人，碩士研究生，講師，主要從事分子生物學(xué)、免疫學(xué)及動(dòng)物疫病防治等方面的研究。E-mail：guohan611@163.com。犬一直被人們視為最忠實(shí)的朋友，可用來陪護(hù)老人、緩解工作壓力、培養(yǎng)兒童的愛心和增進(jìn)少兒的動(dòng)物保護(hù)意識(shí)等。隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，將犬作為生活的樂趣和親密的生活伴侶越來越普遍。近幾年來人們對(duì)寵物的喜好與養(yǎng)殖需求急劇增加，尤其是一些珍貴的犬種具有很好的市場(chǎng)前景，因此寵物犬的繁殖成為了人們高度關(guān)注的問題，而母犬妊娠情況的判斷是這一環(huán)節(jié)的核心問題。血常規(guī)指標(biāo)變化用于妊娠判定在人、牛、豬等方面的研究已有不少報(bào)道，但用于母犬的妊娠判定尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)妊娠早期母犬血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板數(shù)量的檢測(cè)，探討血常規(guī)指標(biāo)變化在母犬早期妊娠診斷中的價(jià)值，以期為臨床母犬的早期妊娠診斷提供更為便捷、準(zhǔn)確有效的方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要儀器及設(shè)備 4 ℃冰箱，上海西門子中外合資有限公司；生物顯微鏡，江南顯微鏡廠；電烘箱，成都電熱儀器廠；萬分之一電子分析天平，瑞士Mettler；Millipor純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipor；改良紐巴氏計(jì)數(shù)板，上海醫(yī)用儀器廠；手動(dòng)計(jì)數(shù)器，上海醫(yī)用儀器廠；血紅蛋白吸管，江蘇醫(yī)用器材廠。

1.1.2主要藥品及試劑 氯化鈉（化學(xué)純，重慶北碚化學(xué)試劑廠），氯化汞（化學(xué)純，天津化學(xué)試劑廠），結(jié)晶硫酸鈉（化學(xué)純，成都化學(xué)試劑廠），石碳酸（化學(xué)純，天津化學(xué)試劑廠），冰乙酸（分析純，重慶川東化學(xué)試劑廠），草酸銨（化學(xué)純，重慶北碚化學(xué)試劑廠）。

紅細(xì)胞稀釋液（姬姆氏液）的制備：取1.0 g氯化鈉，0.5 g氯化汞，5 g結(jié)晶硫酸鈉，200 mL蒸餾水，并加入數(shù)滴碳酸品紅溶液，混合溶解即可。

白細(xì)胞稀釋液的制備：精確量取1 mL冰乙酸，置于 100 mL 容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水稀釋并定容。

血小板稀釋液的制備：精確稱取1 g草酸銨，用蒸餾水溶解，并用100 mL容量瓶定容。

1.1.3血樣的采取選擇商丘藏獒繁殖基地、商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院、商丘市復(fù)康寵物醫(yī)院3個(gè)地方的犬作為采血對(duì)象，用臨床診斷、B超觀察的方法判斷母犬是否妊娠。采用頸靜脈采血法分別采集5 mL妊娠及未妊娠母犬全血，各采血樣20份，分別置于潔凈瓶?jī)?nèi)，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1紅細(xì)胞計(jì)數(shù)參照相關(guān)文獻(xiàn)[1]，具體如下。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)原理：以適當(dāng)?shù)募t血球（red blood cell，RBC）稀釋液將血樣進(jìn)行200倍稀釋，在特制的改良紐巴氏計(jì)數(shù)板上進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，并換算成為 1 mm3 的含量。

紅細(xì)胞測(cè)定方法：用2 mL吸管準(zhǔn)確取2 mL紅細(xì)胞稀釋液于紅細(xì)胞稀釋管中，用Hb吸管準(zhǔn)確吸取10 μL血樣，擦凈吸管周圍血液后插入試管底部，輕輕壓出血液于稀釋液中，再用上清液洗滌吸管數(shù)次，充分混合備用。用小玻棒取1滴稀釋后的血樣，置于計(jì)數(shù)板與蓋玻片交界處，讓其自然浸入，使稀釋血樣擴(kuò)散于計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置2～3 min后用顯微鏡檢測(cè)。

計(jì)數(shù)時(shí)用低倍鏡，計(jì)數(shù)中央大方格中4角和中央1個(gè)中方格（共5個(gè)中方格）、80個(gè)小方格中的紅細(xì)胞數(shù)。為避免重復(fù)和遺漏，計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)按一定順序進(jìn)行，壓在雙線上的細(xì)胞計(jì)算在內(nèi)，計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)按“數(shù)左不數(shù)右，數(shù)上不數(shù)下”的原則，切不可重復(fù)計(jì)數(shù)。將計(jì)數(shù)的結(jié)果代入下列公式，得出1 mm3紅細(xì)胞的數(shù)量：1 mm3血液內(nèi)紅細(xì)胞總數(shù)=A×10 000。式中：A為5個(gè)中方格中紅細(xì)胞總數(shù)，個(gè)。

1.2.2白細(xì)胞計(jì)數(shù)參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]，具體如下。白細(xì)胞測(cè)定原理：用冰乙酸破壞紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1 mm3內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：用1 mL吸管取0.4 mL白細(xì)胞稀釋液于康氏試管中，再用Hb吸管吸20 μL血樣，用潔凈紗布擦去吸管周圍附著的血液，然后插入小試管底部，輕輕壓出血液后用上清液洗滌吸管數(shù)次，充分混勻備用。用小玻棒取1滴稀釋后的血樣，置于計(jì)數(shù)板與蓋玻片交界處，讓其自然浸入，使稀釋血樣擴(kuò)散于計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置2～3 min后用顯微鏡檢測(cè)。白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法相同，按4角大方格中的白細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)，并將計(jì)數(shù)結(jié)果代入下列公式，得出 1 mm3 血液內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)：1 mm3血液內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)=B×50。式中：B為4角大方格中白細(xì)胞總數(shù)，個(gè)。

1.2.3血小板計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行，具體如下：血小板計(jì)數(shù)原理：將血液稀釋后在計(jì)數(shù)室內(nèi)計(jì)數(shù)，按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，數(shù)5個(gè)中方格的血小板總數(shù)乘以10 000，即換算出被檢出的血小板絕對(duì)值；血小板計(jì)數(shù)方法：用2 mL吸管吸取2 mL 1%草酸銨溶液于試管中，再用Hb吸管精確吸取10 μL血樣，并將其吹入試管中，輕輕搖勻，用小玻棒取1滴充入計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置15 min；按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，血小板在鏡中呈橢圓形或不規(guī)則的折光小體。將計(jì)數(shù)結(jié)果代入下列公式，得出1mL血樣中血小板的數(shù)量：血小板值=N×10 000。式中：N為5個(gè)中方格中血小板總數(shù)，個(gè)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 將所得的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示各試驗(yàn)組和對(duì)照組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用非配對(duì)t檢驗(yàn)法，比較各試驗(yàn)組和對(duì)照組的平均值之間的差異。

1.3臨床應(yīng)用

利用本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果，在商丘市商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院等5家寵物醫(yī)院進(jìn)行妊娠犬的前期懷孕判斷，利用本試驗(yàn)的檢測(cè)原理和結(jié)果進(jìn)行判斷，共隨機(jī)測(cè)試了18只配種后早期和中期的母犬。利用B超測(cè)試這些母犬配種后的懷孕情況，并對(duì)2種檢測(cè)結(jié)論進(jìn)行比對(duì)。

2結(jié)果與分析

2.1妊娠母犬與未妊娠母犬血液中紅細(xì)胞數(shù)量變化

調(diào)查的40只母犬中，血液檢測(cè)未妊娠母犬（20只）紅細(xì)胞的數(shù)量為（817.00±144.90）萬個(gè)/mm3，妊娠母犬（20只）血液中紅細(xì)胞的數(shù)量為（678.06±172.53）萬個(gè)/mm3。結(jié)果表明，妊娠母犬血液中的紅細(xì)胞數(shù)量顯著低于未妊娠母犬（P<0.05）。妊娠犬、未妊娠犬紅細(xì)胞數(shù)量的變化范圍分別為340萬～1 017萬個(gè)/mm3、540萬～1 112萬個(gè)/mm3，妊娠犬紅細(xì)胞數(shù)量變化范圍明顯有別于未妊娠犬（表1）。從測(cè)定的變異系數(shù)看，妊娠犬紅細(xì)胞數(shù)量變異系數(shù)明顯高于未妊娠犬，造成這種現(xiàn)象的原因可能與妊娠犬的種類不同、妊娠犬體內(nèi)胎兒大小差異等有關(guān)。

2.2妊娠母犬與未妊娠母犬血液中白細(xì)胞數(shù)量變化

經(jīng)測(cè)定，20只未妊娠母犬血液中的白細(xì)胞數(shù)量為（6 710.00±681.72）萬個(gè)/mm3，而20只妊娠母犬血液中的白細(xì)胞數(shù)量則為（15 299.42±2 629.75）萬個(gè)/mm3。經(jīng)t檢驗(yàn)，妊娠母犬血液中的白細(xì)胞數(shù)量極顯著高于未妊娠母犬（P<001）。所測(cè)定的妊娠、未妊娠犬血液中白細(xì)胞數(shù)量變化范圍分別為5 150～20 450、5 369～8 035個(gè)/mm3，妊娠犬白細(xì)胞數(shù)量變化范圍明顯不同于未妊娠母犬。從測(cè)定的變異系數(shù)看，妊娠犬白細(xì)胞數(shù)量變異系數(shù)明顯高于未妊娠犬（表1）。

2.3妊娠母犬與未妊娠母犬血液中血小板數(shù)量變化

血樣經(jīng)血小板稀釋液稀釋后，在計(jì)數(shù)室內(nèi)計(jì)數(shù)測(cè)定，20只未妊娠母犬血液中血小板的數(shù)量為（23.56±3.45）萬個(gè)/mm3，而20只妊娠母犬血液中血小板的數(shù)量則為（18.30±4.09）萬個(gè)/mm3。經(jīng)t檢驗(yàn)，妊娠母犬血液中的血小板數(shù)量顯著低于未妊娠母犬（P<0.05）。由表1可以看出，所測(cè)定的妊娠、未妊娠犬血液中血小板數(shù)量變化范圍分別為10萬～27萬個(gè)/mm3、17萬～31萬個(gè)/mm3，妊娠犬血小板數(shù)量變化范圍明顯有別于未妊娠母犬。從測(cè)定的變異系數(shù)看，妊娠犬血小板數(shù)量變異系數(shù)明顯高于未妊娠犬（表1）。表1妊娠母犬與未妊娠母犬血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)量

2.4臨床應(yīng)用結(jié)果

在母犬妊娠后的不同時(shí)間，利用本試驗(yàn)血常規(guī)和B超2種診斷方法進(jìn)行妊娠檢測(cè)（表2）。

表2母犬配種后13、32 d血常規(guī)和B超診斷妊娠結(jié)果

檢測(cè)方法測(cè)試犬?dāng)?shù)

（只）陽性數(shù)

（只）實(shí)際陽性數(shù)

（只）準(zhǔn)確率

（%）血常規(guī)檢測(cè)1816/1417/1794.1/82.4B超檢測(cè)180/1717/170/100.0注：“/”前后分別為母犬配種后13、32 d的檢測(cè)結(jié)果。

臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，利用血常規(guī)在母狗妊娠早期進(jìn)行妊娠診斷，具有較高的準(zhǔn)確率，而B超不能在早期檢測(cè)；而在母犬懷孕的中后期利用B超可以方便地測(cè)出母犬懷孕情況，利用血常規(guī)檢測(cè)方法雖能較準(zhǔn)確地測(cè)出結(jié)果，但操作相對(duì)繁瑣。

3討論與結(jié)論

妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，妊娠期母體各器官要發(fā)生一系列變化，以適應(yīng)胎兒發(fā)育成長(zhǎng)需要。卵子與精子在輸卵管壺腹部結(jié)合成為受精卵，然后侵入宮腔，經(jīng)過一系列的生理反應(yīng)，最后完成孕卵“著床”。孕卵著床后逐漸發(fā)育成胚胎及與母體建立聯(lián)系的附屬物（胎盤、胎膜、臍帶及羊水等）。胚胎進(jìn)一步發(fā)育成胎兒，胎兒發(fā)育成熟后娩出，整個(gè)妊娠過程終結(jié)[4]。

母犬整個(gè)妊娠期約58～64 d[5]。妊娠期中1～30 d為妊娠前期，這期間受精卵完成著床、胚胎的發(fā)育，其中1～15 d為妊娠的早期。妊娠期中的30～45 d、45～60 d分別為妊娠的中期、后期，主要完成胎兒的發(fā)育、成熟等過程。養(yǎng)犬生產(chǎn)中，妊娠母犬的早期診斷往往要求在妊娠30 d或之前進(jìn)行，30 d 以后對(duì)妊娠母犬的檢查多用于胎兒發(fā)育情況、胎位等情況的監(jiān)測(cè)，這期間還可用X線透視或攝影等方法診斷胎兒的個(gè)數(shù)、大小等。

性激素影響紅細(xì)胞的生成，其中睪酮可促進(jìn)紅細(xì)胞生成素的生成，而雌激素則抑制其生成。母犬妊娠期間，體內(nèi)增加的雌激素會(huì)抑制紅細(xì)胞生成素的形成，影響妊娠母犬機(jī)體紅細(xì)胞的生產(chǎn)[6-8]。另一方面，母犬妊娠期間，母體代謝活動(dòng)的增強(qiáng)，對(duì)紅細(xì)胞的衰老有促進(jìn)作用。這兩方面因素的作用，造成了母犬妊娠機(jī)體紅細(xì)胞數(shù)量偏低。試驗(yàn)結(jié)果表明，所調(diào)查的母犬中，未妊娠母犬血液中紅細(xì)胞的數(shù)量為（817±14490）萬個(gè)/mm3，而妊娠母犬血液中紅細(xì)胞的數(shù)量?jī)H為（678.06±172.53）萬個(gè)/mm3，妊娠母犬血液中的紅細(xì)胞數(shù)量顯著低于未妊娠母犬（P<0.05）。張秀玲等對(duì)妊娠婦女血液中紅細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果均顯著低于非妊娠婦女血液中紅細(xì)胞數(shù)值[9]。劉續(xù)春對(duì)1 328例妊娠婦女血液中血紅蛋白進(jìn)行了分析，表明產(chǎn)前孕婦血紅蛋白含量明顯低于正常人[10]。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述報(bào)道相符，從妊娠診斷的角度，妊娠母犬血液中紅細(xì)胞的數(shù)量降低，可以作為健康母犬妊娠與否的早期診斷指標(biāo)之一。

白細(xì)胞在動(dòng)物機(jī)體免疫保護(hù)中起著重要的作用。如淋巴細(xì)胞是免疫細(xì)胞，主要發(fā)揮體液免疫和細(xì)胞免疫作用，對(duì)病源微生物有殺滅作用[11]。臨床中白細(xì)胞總數(shù)增多，一般與機(jī)體感染性疾病有關(guān)。

關(guān)于妊娠是否會(huì)引起婦女或母畜容易發(fā)生感染性疾病的報(bào)道還很少，但卻有妊娠婦女血液中白細(xì)胞總數(shù)增高的報(bào)道。劉續(xù)春對(duì)1 328例孕婦血液中白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示80%以上的孕婦嗜中性白細(xì)胞增多[10]。張秀玲等對(duì)妊娠中、晚期婦女血液中白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)妊娠中期婦女血液中白細(xì)胞極顯著性高于未妊娠婦女[9]。在本試驗(yàn)中，20只未妊娠母犬血液中的白細(xì)胞數(shù)量為（6 710.00±68172）萬個(gè)/mm3，而20只妊娠母犬血液中的白細(xì)胞數(shù)量則為（15 299.42±2 629.75）萬個(gè)/mm3。妊娠母犬血液中的白細(xì)胞數(shù)量極顯著高于未妊娠母犬，這一結(jié)果與上述報(bào)道相符。妊娠期白細(xì)胞增高雖然是一個(gè)較復(fù)雜的生理現(xiàn)象，但從妊娠診斷的角度看，上述研究結(jié)果表明母畜血液白細(xì)胞總數(shù)增多可作為妊娠陽性判斷的參考指標(biāo)之一。

血小板是形態(tài)不規(guī)則的小體，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血小板顯著減少是早孕的一種生理反應(yīng)，根據(jù)血小板是否顯著減少就可對(duì)交配后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)的母畜作出超早期妊娠診斷[12]。馬群山等對(duì)45頭配種后三江母豬外周血小板數(shù)值進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明三江母豬妊娠后外周血小板數(shù)目明顯降低[13]；張壽用血小板計(jì)數(shù)法對(duì)60頭高原母豬進(jìn)行了超早期妊娠診斷，結(jié)果表明妊娠與未妊娠診斷的符合率達(dá)到93%以上[14]；李助南等對(duì)20頭未妊娠奶牛和22頭妊娠奶牛外周血小板數(shù)值進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)妊娠奶牛血小板數(shù)值極顯著低于未妊娠奶牛，對(duì)30頭配種后奶牛進(jìn)行了超早期診斷，發(fā)現(xiàn)其符合率在83%以上[15]。本研究分別測(cè)定了20只未妊娠母犬及20條妊娠母犬血液中血小板的數(shù)量，結(jié)果表明妊娠母犬血液中的血小板數(shù)量顯著低于未妊娠母犬（P<0.05）。這一結(jié)果與上述報(bào)道相符，從母犬妊娠診斷的角度來看，健康母犬外周血液中血小板數(shù)目降低，可以作為妊娠診斷的臨床指標(biāo)之一。

通過臨床試驗(yàn)研究，表明測(cè)定配種后母犬外周血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的數(shù)目，可以作為獸醫(yī)臨床母犬早期妊娠診斷的指標(biāo)，具有較高的準(zhǔn)確率。

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