劉賽君， 郭梅艷， 鄧列華， 趙 剛， 胡云峰

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510630； 2河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

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亞硒酸鈉對UVB損傷人角質(zhì)形成細(xì)胞的保護(hù)作用

劉賽君1▲， 郭梅艷2▲， 鄧列華1△， 趙 剛1， 胡云峰1

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510630；2河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

目的： 研究亞硒酸鈉(Na2SeO3)對中波紫外線(UVB)損傷人角質(zhì)形成細(xì)胞的保護(hù)作用。方法： 培養(yǎng)永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)，實驗分為4組處理：(1)正常對照組；(2)Na2SeO3組：分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 μmol/L 的Na2SeO3預(yù)孵育24 h；(3)UVB組：300、600和900 J/m2UVB照射；(4)Na2SeO3+UVB組：Na2SeO3預(yù)孵育24 h后進(jìn)行UVB照射。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，采用流式細(xì)胞儀檢測300 J/m2UVB照射后細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果： (1)UVB組與正常對照組比較，細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活性與UVB照射劑量呈負(fù)相關(guān)；(2)Na2SeO3組與正常對照組比較，細(xì)胞增殖活性無明顯差異；(3)不同濃度Na2SeO3+UVB組與UVB組比較，細(xì)胞增殖活性增加，差異顯著(P<0.05)，其中100 nmol/L組促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)；(4)300 J/m2UVB照射后，不同濃度Na2SeO3+UVB組與UVB組比較，凋亡率下降，差異顯著(P<0.05)，其中100 nmol/L組抑制凋亡作用最強(qiáng)。結(jié)論： UVB對角質(zhì)形成細(xì)胞有損傷作用，且與照射劑量呈正相關(guān)；Na2SeO3具有光保護(hù)性能，可減輕UVB輻射損傷人角質(zhì)形成細(xì)胞。

紫外線； 角質(zhì)形成細(xì)胞； 光保護(hù)； 亞硒酸鈉

長期、過量的紫外線輻射可導(dǎo)致皮膚日曬傷、光老化甚至皮膚腫瘤[1-2]。中波紫外線(ultraviolet-B, UVB)是造成皮膚光損傷的主要原因[3]。角質(zhì)形成細(xì)胞位于皮膚表皮層，是UVB作用的靶細(xì)胞。UVB引起皮膚光損傷的機(jī)制較復(fù)雜，最為重要的一點(diǎn)是通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的活性氧簇[4]，破壞細(xì)胞膜、線粒體膜及使各種細(xì)胞酶類失活，并影響相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡或癌變，從而引起皮膚光老化，誘發(fā)皮膚癌等。

微量元素硒是機(jī)體重要的抗氧化酶——谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的必需組分，具有抗氧化、抗腫瘤[5]、保護(hù)心肌和肝細(xì)胞[6-7]、提高免疫功能的作用，與人體健康密切相關(guān)。研究表明硒與一些皮膚病如銀屑病、白癜風(fēng)、皮膚腫瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，亞硒酸鈉(sodium selenite，Na2SeO3)是一種常用的人體補(bǔ)硒制劑。本論文擬研究不同劑量Na2SeO3處理對UVB照射損傷永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)的保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT細(xì)胞)購自中國典型培養(yǎng)物武漢大學(xué)保藏中心。

胰蛋白酶和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)粉(Sigma)；MEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(天津市灝洋生物制品公司)；Na2SeO3(廣州化學(xué)試劑廠)；UVB燈管(北京電光源研究所)；紫外線輻照計(北京師范大學(xué)光電儀器廠)；CO2培養(yǎng)箱(NAPCO)；可見光分光光度計(PERKIN ELMER)；流式細(xì)胞儀(Coulter)；倒置相差顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將處于亞融和狀態(tài)的細(xì)胞用0.25%胰酶和0.03% EDTA消化傳代，1×108/L細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板中。

2.2 分組處理 HaCaT細(xì)胞處理分為4組：(1)正常對照組；(2)Na2SeO3組：加入1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 μmol/L的Na2SeO3預(yù)孵育24 h；(3)UVB組：細(xì)胞用300、600和900 J/m2的UVB照射；(4)Na2SeO3+UVB組：Na2SeO3預(yù)孵育24 h后行UVB照射；每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次。

2.3 UVB 照射 2根平行UVB燈管，波長為308 nm，功率為8 W，光源距培養(yǎng)板垂直距離為6 cm，用UVB紫外線輻照計標(biāo)定輻照強(qiáng)度為2 W/m2。UVB劑量=UVB輻照強(qiáng)度(W/m2)×?xí)r間(s)，劑量300、600和900 J/m2。照射前吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，再加入少量PBS覆蓋底面。UVB照射后，棄去覆蓋液PBS，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 光損傷的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞損傷的形態(tài)變化并攝像。

2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 向每100 μL培養(yǎng)基中加入20 μL濃度為5 g/L的MTT，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，室溫下振蕩15 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解，選擇490 nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(A值)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 經(jīng)300 J/m2UVB照射后，分別檢測正常對照組、UVB組和Na2SeO3+UVB組細(xì)胞的凋亡率。將各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，以體積分?jǐn)?shù)80%乙醇固定。PBS清洗細(xì)胞3次。取出4 ℃保存的含50 mg/L Triton的碘化丙啶，于各試驗管中分別加入200 μL碘化丙啶，振蕩成單細(xì)胞懸液，避光室溫靜置30 min。300目濾網(wǎng)過濾后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 UVB照射損傷HaCaT的形態(tài)學(xué)觀察

正常對照組的HaCaT細(xì)胞呈典型上皮樣特征，高核漿比例，細(xì)胞排列緊密，輪廓清楚折光好。UVB組細(xì)胞受到不同程度損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞逐漸變圓、皺縮，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞腫脹、細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞損傷程度與UVB照射劑量呈正相關(guān)，見圖1。

Figure 1.The effect of different doses of UVB irradiation on morphology of HaCaT cells (×100).

2 UVB照射對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)MTT檢測發(fā)現(xiàn)UVB組A值低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明不同劑量UVB照射后24 h，HaCaT細(xì)胞增殖活性下降，細(xì)胞活性與UVB照射劑量呈負(fù)相關(guān)。

Na2SeO3組細(xì)胞活性與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)，說明所加藥物在實驗濃度對細(xì)胞無毒性作用。

濃度為1 nmol/L的Na2SeO3+UVB組細(xì)胞活性與UVB組比較無顯著差異(P>0.05)；其它濃度的Na2SeO3+UVB組的細(xì)胞活性與UVB組比較細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)，其中100 nmol/L組細(xì)胞活性最高,見表1。

表1 UVB照射和Na2SeO3處理后MTT實驗的吸光度值

#P<0.05vsnormal control group (0 J/m2UVB);*P<0.05vsUVB group (0 nmol/L Na2SeO3).

3 Na2SeO3對UVB照射后HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，在用碘化丙啶熒光染料分析圖上，經(jīng)300 J/m2UVB照射后，HaCaT細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)亞二倍體峰，UVB組凋亡率與正常對照組相比較，差異顯著(P<0.05)，表明UVB輻射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生凋亡。

經(jīng)300 J/m2UVB照射后，1 nmol/L Na2SeO3+UVB組的細(xì)胞凋亡率與UVB組比較無顯著差異(P>0.05)；其它濃度的Na2SeO3+UVB組細(xì)胞凋亡率較UVB組明顯下降(P<0.05)，其中100 nmol/L組凋亡率最低。這說明Na2SeO3對UVB照射致HaCaT細(xì)胞損傷具有光保護(hù)作用，抑制其凋亡,見圖2。

Figure 2.The effects of Na2SeO3 on the apoptotic rate of HaCaT cells induced by 300 J/m2 UVB. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs UVB group.

討 論

日光中的紫外線對皮膚曬傷、皮膚炎癥、皮膚老化與皮膚癌的發(fā)生與發(fā)展有重要影響[1-3]。自然界能穿過臭氧層引起人皮膚損傷的紫外線成分是UVB(280～315 nm)和UVA(315～400 nm)，UVB對皮膚的損傷強(qiáng)度比UVA大800～1 000倍，且UVB有更強(qiáng)的誘變性和致癌性，是造成皮膚光損傷的主要原因[2-3]。一般認(rèn)為，UVB照射損傷皮膚細(xì)胞，其具體機(jī)制較為復(fù)雜。王會營等[9]認(rèn)為HaCaT細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后，線粒體去極化作用增強(qiáng)、質(zhì)量降低，這些變化與細(xì)胞凋亡相關(guān)。此外，紫外線能誘導(dǎo)皮膚產(chǎn)生過多的活性氧簇，引起細(xì)胞凋亡造成皮膚損傷[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，300、600和900 J/m2UVB照射均導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞增殖活性下降，且其程度與UVB照射劑量呈正相關(guān)。同時，結(jié)果也表明300 J/m2UVB輻射即可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為，UVB到達(dá)地球表面時輻射強(qiáng)度約為180～300 J/m2[10]，這說明正常日曬條件下的UVB劑量即可損傷皮膚。研究表明，局部外用抗氧化劑如維生素C和E、茶多酚等可以減緩紫外線損傷皮膚[11]。

硒是人體必需的微量元素，適量的硒化合物可保護(hù)細(xì)胞和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)功能不受氧化作用的損傷。而關(guān)于硒緩解紫外線損傷皮膚的研究也有不少報道，如Burke等[12]發(fā)現(xiàn)局部外用硒蛋氨酸可以減輕UV輻射引起的炎癥和色素沉著，并可降低UV誘發(fā)的皮膚腫瘤的數(shù)量。Rafferty等[13]則發(fā)現(xiàn)10 nmol/L～1 μmol/L 的Na2SeO3具有光保護(hù)作用，能抑制寬譜紫外線(包括UVB、UVA和少量UVC)輻射引起的原代培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。而我們的研究也發(fā)現(xiàn)，10 nmol/L～1 μmol/L Na2SeO3能抑制UVB照射引起的HaCaT細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞增殖活性，說明亞硒酸鈉對HaCaT細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用。從本論文研究結(jié)果來看，100 nmol/L為其最佳保護(hù)濃度。但硒對UVB輻射的光防護(hù)作用機(jī)制目前仍未完全清楚，尚待進(jìn)一步研究闡明。一般認(rèn)為，硒化合物在體內(nèi)主要是通過硒蛋白介導(dǎo)其保護(hù)作用。人類皮膚細(xì)胞表達(dá)至少15種硒蛋白，包括谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶家族，均有抗氧化活性，能減緩紫外線對皮膚造成的氧化損傷。UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡由Fas或P53通路介導(dǎo)，氧化應(yīng)激參與P53的激活[13]。有研究認(rèn)為硒化合物具有抗氧化作用，能抑制UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞P53激活和蛋白聚集[14]，從而阻止細(xì)胞凋亡。此外Na2SeO3能抑制UVB誘導(dǎo)的caspase-3活化，而caspase-3是UV輻射通過能量沉積損傷細(xì)胞的關(guān)鍵酶[15]。

[1] Chen HX, Weng Q, Fisher DE. UV signaling pathways within the skin [J]. J Invest Dermatol, 2014, 134(8):2080-2085.

[2] D’Orazio J, Jarrett S, Amaro-Ortiz A, et al. UV radiation and the skin [J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(6):12222-12248.

[3] Ichihashi M, Ueda M, Budiyanto A, et al. UV induced skin damage [J]. Toxicol, 2003, 189(1-2):21-39.

[4] Chen L, Hu JY, Wang SQ. The role of antioxidants in photoprotection: a critical review [J]. J Am Acad Dermatol, 2012, 67(5):1013-1024.

[5] 鄭軍生，周 潔，李小毛, 等. 亞硒酸鈉對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(12):2258-2264.

[6] 潘曉青，魏 瑾，張 明，等. 低硒大鼠心肌線粒體硫氧還蛋白2的動態(tài)表達(dá)和心肌的損傷情況[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(12):2130-2134.

[7] 陳顯兵, 管小琴. 亞硒酸鈉對體外培養(yǎng)的慢性乙型肝炎患者外周樹突狀細(xì)胞功能的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(4): 815-816.

[8] 冀 然, 蔣 獻(xiàn). 硒與皮膚病[J]. 國際皮膚性病學(xué)雜志, 2006, 32(2):111-113.

[9] 王會營, 曾耀英, 王 通, 等. 紫外線對角質(zhì)細(xì)胞線粒體功能及凋亡的影響研究[J]. 中國病理生理雜志, 2006, 22(5):1020-1023.

[10]Kimura H, Minakami H, Otsuki K, et al. Cu-Zn superoxide dismutase inhibits lactate dehydrogenase release and protects against cell death in murine fibroblasts pretreated with ultraviolet radiation[J]. Cell Biol Int, 2000, 24(7):459-465.

[11]Burke KE. Photoaging: the role of oxidative stress [J]. G Ital Dermatol Venereol, 2010, 145(4): 445-459.

[12]Burke KE, Clive J, Combs GF, et al. Effects of topical L-selenomethionine with topical and oral vitamin E on pigmentation and skin cancer induced by ultraviolet irradiation in Skh:2 hairless mice[J]. J Am Acad Dermatol, 2003, 49(3):458-472.

[13]Rafferty TS, Beckett GJ, Walker C, et al. Selenium protects primary human keratinocytes from apoptosis induced by exposure to ultraviolet radiation[J]. Clin Exp Dermatol, 2003, 28(7):294-300.

[14]Traynor NJ, McKenzie RC， Beekett GJ, et al. Selenomethionine inhibits ultraviolet radiation-induced p53 transactivation[J]. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 2006, 22(6):297-303.

[15]McKenzie RC. Selenium, ultraviolet radiation and the skin[J]. Clin Exp Dermatol, 2000, 25(8):631-636.

Protective effect of sodium selenite on human keratinocytes from ultraviolet-B irradiation

LIU Sai-jun1, GUO Mei-yan2, DENG Lie-hua1, ZHAO Gang1, HU Yun-feng1

(1DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China;2AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056002,China.E-mail:liehuadeng@126.com)

AIM: To investigate the protective effect of sodium selenite (Na2SeO3) on human keratinocytes under ultraviolet-B (UVB) irradiation. METHODS: The cultured HaCaT cells were divided into 4 groups: (1) normal control group; (2) Na2SeO3group: pretreated with Na2SeO3at doses of 10 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L, 200 nmol/L and 1 μmol/L for 24 h; (3) UVB group: irradiated with UVB at doses of 300, 600 and 900 J/m2; (4) Na2SeO3+ UVB group: after pretreated with Na2SeO3for 24 h, irradiated with UVB at doses of 300, 600 and 900 J/m2. The cell proliferation was detected by MTT assay. The apoptotic rates of HaCaT cells treated with UVB at dose of 300 J/m2were assessed by flow cytometry. RESULTS: Compared with normal control group, the cell proliferation activity in UVB group decreased significantly (P<0.05). The cell activity was inversely correlated with the irradiation intensity. No significant difference of the cell activity between Na2SeO3group and normal control group was observed. The cell proliferation in Na2SeO3+UVB group was higher than that in UVB group significantly (P<0.05). Na2SeO3at concentration of 100 nmol/L showed the strongest activity to promote cell proliferation. After 300 J/m2UVB irradiation, the apoptotic rate in Na2SeO3+UVB group decreased significantly (P<0.05) compared with UVB group. The inhibitory effect of Na2SeO3at concentration of 100 nmol/L on apoptosis was the strongest.CONCLUSION: The damage of human keratinocytes by UVB irradiation is in a dose-dependent manner. The photoprotection performance of Na2SeO3reduces the damage of human keratinocytes induced by UVB irradiation.

Ultraviolet rays; Keratinocytes; Photoprotection; Sodium selenite

1000- 4718(2015)01- 0177- 04

2014- 08- 25

2014- 11- 10

△通訊作者 Tel： 020-38688115; E-mail: liehuadeng@126.com

▲并列第1作者

R758.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.033