白小藝， 章 鈞， 田 琪， 林俊偉， 侯紅瑛△

(中山大學附屬第三醫(yī)院 1產科，2產科實驗室，廣東 廣州 510630)

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單核苷酸多態(tài)性芯片與染色體核型分析在唐氏篩查高風險孕婦產前診斷中的比較研究*

白小藝1， 章 鈞2， 田 琪2， 林俊偉2， 侯紅瑛1△

(中山大學附屬第三醫(yī)院1產科，2產科實驗室，廣東 廣州 510630)

目的： 探討單核苷酸多態(tài)性芯片(SNP array)在唐氏篩查高風險孕婦胎兒染色體分析中的應用價值。方法: 選取312例因唐氏篩查高風險的孕婦，行羊膜腔穿刺術后獲得羊水，對羊水進行G顯帶核型分析和SNP array檢測，比較核型分析與SNP array檢測結果，并按年齡分組比較拷貝數變異(CNVs)的發(fā)生率差別。結果: 核型分析和SNP array均準確發(fā)現2例21三體(0.64%),6例核型分析提示染色體平衡重組(1.92%)的樣本經SNP array分析證實不存在重排片段重復或缺失。在303例核型正常的胎兒羊水細胞中，SNP array檢測發(fā)現176例CNVs，其中良性CNVs 106例,臨床意義不明確的CNVs(VOUS)61例，新發(fā)CNVs(denovoCNVs)9例,未發(fā)現已知的致病性CNVs。唐氏篩查高風險組與唐氏篩查高風險合并高齡組CNVs的分布差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，本研究中首次報道14種CNVs。結論: SNP array 可進一步確定核型分析的平衡易位是否存在染色體微缺失/重復。在核型正常的胎兒中，SNP array可檢測出大量拷貝數異常，發(fā)現14種新的CNVs但現有數據庫無法判斷其臨床意義，需進一步研究確認。此外，孕婦年齡對胎兒基因組中新發(fā)CNVs的發(fā)生率無明顯影響。

單核苷酸多態(tài)性芯片； 染色體核型分析； 拷貝數變異； 產前診斷

20世紀70年代,以G顯帶技術為主的染色體核型分析在產前診斷中開始應用,可減少染色體數目和結構異常的胎兒出生的數量, 提高人口出生素質。但每年仍有0.65%新出生人口存在染色體異常導致先天性疾病的發(fā)生，0.2%新出生人口存在染色體重排并影響其生殖功能[1-2]。核型分析能檢測出染色體數目異常，不平衡結構畸形，明顯的平衡結構異常等染色體畸變，但核型分析存在檢測深度低、耗時長、培養(yǎng)失敗率較高、判讀結果主觀及易發(fā)生人為錯誤等缺點，使它在產前診斷的應用存在一定的局限性[3]。

近年來，以微陣列-比較基因組雜交(array comparative genomic hybridisation,aCGH)和單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism array,SNP array)為平臺的染色體微陣列技術(chromosome microarray analysis,CMA)用于臨床細胞遺傳學領域及染色體病的研究，可對染色體亞微結構異常進行診斷定位。CMA在產后發(fā)育遲緩/智力障礙、自閉癥譜系障礙和多發(fā)性先天畸形疾病中檢測出比核型分析高15%～20%檢出率，可取代G顯帶分析技術，成為一線檢測手段[4-6]。但其在產前診斷中，特別是對于唐氏篩查高風險的孕婦進行產前診斷的應用價值尚不明確。為了研究SNP array是否比傳統(tǒng)核型分析對遺傳物質的異常具有更高檢出率，我們對312例因唐氏篩查高風險而行產前診斷的孕婦胎兒樣本進行了核型分析和SNP array檢測，探討SNP array在唐氏篩查高風險孕婦人群中的應用價值。

材 料 和 方 法

1 研究對象

2013年3月～2014年8月在中山大學附屬第三醫(yī)院因唐氏篩查高風險(早孕或中孕唐氏篩查21三體風險值≥1∶270)行羊膜腔穿刺術進行產前診斷的孕婦，排除染色體培養(yǎng)失敗和(或)SNP array分析失敗以及拒絕行SNP array檢測的病例，共收集312例孕婦的羊水標本成功進行核型分析及SNP array檢測。312例孕婦的一般情況如表1所示。

表1 行SNP array檢測312例孕婦的一般情況

Table 1.Basic information of 312 pregnant women for SNP array analysis

VariableData(Mean±SD)Data[n(%)]Age(year)31.85±5.13—Gestationalweeks20.01±2.08—Parity Nulliparity—170(54.49)Multiparity—142(45.51)Indication DSabnormality—210(67.31)DSabnormality+advancedage—102(32.69)

DS: Down’s syndrome.

2 核型分析實驗步驟

行羊膜腔穿刺術抽取羊水20 mL，分離后加入Gibco羊水培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)10～14 d，收獲羊水細胞經過消化、固定、制片、烤片、顯帶與染色制得玻片。最后在油鏡下計數分析細胞核型。每1標本計數20個核型，至少分析3個核型，記錄核型分析結果。

3 SNP array檢測過程

2013年3月1日～2013年6月5日共有50例孕婦羊水細胞SNP array采用Illumina Human Cyto SNP12芯片(含30萬個遺傳標記探針)進行分析，2013年6月6日～2014年8月31日共有262例孕婦羊水細胞SNP array采用OmniZhongHua-8(含90萬個遺傳標記探針)進行分析。基本步驟包括提取羊水細胞DNA,DNA擴增、片段化、沉淀、重懸、與芯片雜交、芯片的延伸、染色及包被、芯片掃描及數據分析等。SNP array發(fā)現的拷貝數變異(copy number variants,CNVs)>100 kb則通過實時熒光PCR、多重連接探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)或高通量測序進行確定。對CNVs的性質和判讀參考實驗室內部數據庫、在線公共數據庫DECIPHER、ISCA、DGV和Pubmed。根據檢索的結果及父母的比對，將CNVs分為良性(benign)CNVs、致病性(pathogenicity)CNVs、不明意義的CNVs(variants of unknown significance，VOUS)、未包含基因片段的無義(no significance)CNVs及新發(fā)現(denovo)CNVs[5]。

4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0處理,定量資料的描述性分析以均數±標準差(mean±SD)表示,兩組間分類資料的比較使用2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 核型分析結果

312例孕婦羊水細胞經過培養(yǎng)后均成功進行核型分析，303例胎兒核型呈正常核型，占所有孕婦97.12%； 21三體綜合征的胎兒2例，占0.64%；染色體臂間倒位5例，占1.60%，其中發(fā)生在5號染色體1例，9號染色體4例；嵌合型染色體易位1例，是發(fā)生在8號和11號染色體之間的易位；嵌合型marker染色體1例，見表2。

2 SNP array結果分類

在312例孕婦的羊水細胞進行SNP array檢測,排除<100 kb的檢測結果，歸納相同種類的CNVs后，共檢測出325種≥100 kb的CNVs,其中87種CNVs內未包含或覆蓋基因,即為無義CNVs，占26.77%；在238種 包含基因的CNVs中，其中良性CNVs有179種，占55.08%； VOUS有45種，占13.84%;未發(fā)現明確致病性CNVs。在檢測出的CNVs中，良性和無義的CNVs占多數，為81.85%(266/325)。上述CNVs中未在數據庫中有報道我們新發(fā)現的CNVs有14種，占4.31%，見表3。

表2 312例唐氏篩查高風險孕婦羊水細胞核型分析結果

Table 2.Chromosome karyotyping results of 312 pregnancy with Down’s syndrome screening abnormality

KaryotypenProportion(%)46,XX15449.3646,XY14947.7647,XX,+2120.6446,XX,inv(5)(p15.3q11)10.3246,XX,inv(9)(p11q13)10.3246,XY,inv(9)(p11q13)30.9647,XX,+mar/46,XX10.3246,XX,t(8;11)(q12.2;p15)/46,XX10.32

Inv: inversion; t:translocation; mar:marker chromosome.

表3 312例孕婦羊水細胞SNP array 分析結果

Table 3.SNP array analysis results of 312 pregnancy with Down’s syndrome screening abnormality

CNVsnProportion(%)Nosignificance8726.77Benign17955.08Pathogenicity00VOUS4513.84Denovo144.31Total325100.00

3 對染色體畸變檢測結果比較

染色體畸變，即染色體數目和結構異常，核型分析檢出率為2.88%(9/312),包括數目異常3例(2例為21三體和1例marker染色體)和結構異常(染色體臂間倒位5例和易位1例)，見表2。SNP array檢測出2例21三體的羊水細胞，與核型分析結果一致；對于平衡染色體重排，包括核型能檢測出的倒位和易位，在我們的研究中，檢出率為0，能夠進一步確定所檢測樣本的染色體重排為平衡的，不存在染色體片段的缺失和重復。本次研究中，有一例嵌合型含marker染色體的病例，含marker的細胞比例為26.67%，該病例SNP array未能檢測出具有臨床意義的CNVs，這也更加確定該marker染色體中不包含染色體微重復/缺失，證實該marker染色體不具有致病性?？傮w看來，SNP array可檢測出非整倍體數目異常，對于平衡的染色體重排不能檢出，見表4。

表4 核型分析與SNP array檢測染色體畸變結果比較

Table 4.Comparison of the results between karyotyping and SNP array in detecting chromosome abnormality

TypeKaryotyping(n)SNParray(n)21trisomy22Inversion50Translocation10Mosaicmarkerchromosome10Total92

4 303例染色體核型正常的胎兒SNP array的結果

在303例核型正常(46，XX或46,XY)的胎兒中，對其SNP array的結果進行進一步的分析。在統(tǒng)計過程中，若胎兒既有良性CNVs又有VOUS時，將其歸類為VOUS組；若胎兒既有VOUS又有新發(fā)現的CNVs，將其歸類為VOUS組；若胎兒既有良性CNVs又有新發(fā)現的CNVs，將其歸類為新發(fā)現CNVs。在303例核型正常的胎兒中，106例胎兒CNVs為良性，更加確定其遺傳物質不具有致病性；61例胎兒CNVs為意義不明的CNVs。此外，在9例胎兒中發(fā)現現有數據庫尚未報道的CNVs，為我們首次報道的CNVs。同時，我們將年齡進行分組，探討高齡與CNVs性質的關系發(fā)現,高齡不會導致VOUS發(fā)生風險增高(P>0.05)，見表5。

5 新發(fā)現的CNVs

在本次研究中，我們發(fā)現14種未在現有數據庫中有報道的CNVs，如表6所示。這些CNVs的意義不明，需要我們對其進行追蹤，以明確這些CNVs的意義。同時，這些CNVs也可豐富我們當地及國際數據庫，為以后的研究者提供數據參考。

討 論

近年來，隨著 aCGH 和 SNP array技術出現和不斷成熟, CMA迅速發(fā)展成為一個了解基因和患者遺傳病因的有力工具[7]。傳統(tǒng)核型分析檢測深度平均只有7～10 Mb，染色體微陣列分析可以檢測出5～100 kb的亞微結構 CNVs，比核型分析的檢測閾值提高了至少100倍。染色體微陣列分析在產后發(fā)育遲緩/智力低下、多發(fā)先天性畸形、自閉癥譜系疾病中已取代核型分析成為主要的檢測方法，可以檢出比核型分析多10%～15%的染色體亞微結構重排[5]。但染色體微陣列分析在臨床產前診斷中的應用仍缺乏大樣本前瞻性的隊列研究，在產前診斷中的適用人群、應用指征、結果解釋等方面尚未得到一致的意見。2013年美國婦產科醫(yī)師協會和母胎醫(yī)學會發(fā)布了染色體微陣列分析在產前診斷中應用的實踐指南，建議在產前超聲發(fā)現胎兒有一個或多個結構異常的孕婦行介入性產前診斷時，推薦使用染色體微陣列分析，可取代核型分析；在超聲提示胎兒結構正常的孕婦行介入性產前診斷時，可使用核型分析或染色體微陣列分析[3]。

表5 303例核型正常的胎兒SNP array的結果比較

表6 14種新發(fā)現的CNVs

在本次研究中，我們成功地對312例因唐氏篩查高風險行介入性產前診斷的孕婦進行了核型分析和SNP array檢測，對比SNP array和核型分析對染色體畸變的檢測結果，核型分析和SNP array均一致地檢測出2例(0.64%)21三體(47,XX,+21)胎兒，這與Wapner等[8]研究結果一致，SNP array能準確檢測非整倍體數目異常。染色體平衡易位和倒位的發(fā)生率為0.7%，由于染色體的平衡重組，未涉及遺傳物質的獲得或丟失，現有染色體微陣列分析技術不能檢測出染色體的平衡重組[9]。Wapner等[8]在4 282例患者中，核型分析發(fā)現了40例染色體平衡重組，CMA均未成功檢出。在我們的研究中，SNP array也未能檢測出6例(1.92%)核型發(fā)現的染色體平衡(包括5例染色體臂間倒位和1例易位)，這也就更加確定這6例胎兒的染色體重組是平衡的，未涉及遺傳物質的獲得和丟失。此外，遺傳性平衡易位導致胎兒產生明顯的表型的風險較低，一般在胎兒本身不會有致病性，但是可能會對胎兒的成年后的生育產生影響[8, 10]，這需要在產前咨詢中與父母準確解釋。

在染色體微陣列分析中， VOUS增加了臨床咨詢和處理的復雜性，同時，這也可能導致患者及家屬心理上的焦慮以及造成正常妊娠的終止[11]。關于VOUS的檢測率，各個研究報道不一致，平均為2.3%[9, 12-13]。造成VOUS檢出差異的原因之一在于使用的染色體微陣列分析的平臺的檢測深度不一致，CMA檢測率越高，VOUS的數量越多。Hillman等[14]對比了12個隊列研究發(fā)現，VOUS的檢出率與CMA整體檢出率是呈正相關關系(Spearman系數=0.81，P<0.01)。減少VOUS的結果，可通過檢測雙親的染色體、規(guī)范CNVs的判斷標準以及及時更新數據庫的信息等，可將VOUS控制在1%范圍內[10]。我們的研究中，在61例(20.13%)胎兒中發(fā)現VOUS，明顯高于國外的其它研究，其中原因之一為未對胎兒雙親進行SNP array的檢測。由于SNP array的費用比較昂貴，是傳統(tǒng)核型分析的2～3倍，以及對SNP array的價值的認識不足，胎兒雙親絕大多數拒絕繼續(xù)行SNP array，這是我們此次研究的不足之處。再者，我們研究中86.47%(262/303例)的SNP array使用的是OmniZhongHua-8芯片，含有90萬個遺傳標記探針，該芯片首次在我們研究中使用，可參考的數據信息不足。因此，可能造成本次研究中VOUS的檢出率遠遠高于文獻報道。在后續(xù)的研究中，我們繼續(xù)追蹤胎兒的超聲檢查結果，以及出生后的情況，以明確這部分VOUS的意義。

目前，對于母體血清學異常的孕婦行胎兒染色體微陣列分析的研究較少，且研究中的樣本量少。對于母體血清學異常，文獻報道，胎兒致病性CNVs檢出率為1.54%(0～5.2%),共 28/1 810例。對于高齡孕婦行CMA檢測，致病性CNVs檢出率為1.16%(0.3～1.7%)，共74/6 359例[8-10, 12-13, 15-17]。在我們研究中唐氏篩查高風險的孕婦行SNP array檢測，未檢出致病性CNVs，檢出率為0，這與Fiorentino等[9]及Lee等[15]的報道一致。因此，在唐氏篩查異常的孕婦行介入性產前診斷時，進行SNP array檢測是否能提高檢出率，SNP array對這部分孕婦是否有價值仍需要進一步更大樣本的研究。

CNVs在人類基因組中是很常見的。不同的人種、民族等，可能會有不同的CNVs富集。在本次研究中，我們首次報道14種新發(fā)現的CNVs,在現有的數據庫中未找到類似的CNVs。對于這部分CNVs，我們應進行雙親的檢測，以確定這部分CNVs是家族遺傳的還是新突變的;對于新突變的CNVs以及這部分CNVs的意義，需對胎兒進行超聲檢查以及出生后情況的追蹤，以明確該部分CNVs的性質，豐富CMA數據庫，以便CMA在產前診斷中得到更好的應用。

總之，本次研究是首次在中國大陸地區(qū)唐氏篩查高風險的孕婦中進行大樣本SNP array檢測。SNP array能準確檢測非整倍體數目異常，不能檢測染色體平衡重組，SNP array 可進一步確定核型分析的平衡易位是否存在微缺失/重復。在核型正常的胎兒中，我們發(fā)現20.13% 的胎兒中出現VOUS,未檢測出致病性CNVs。同時，我們首次報道檢測出14種新發(fā)現CNVs，而VOUS和denovoCNVs的臨床意義需要進一步跟蹤認識。

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抑制糖原合成酶激酶3可誘導人胰腺癌細胞的促存活自噬信號

糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3, GSK3)是一種在細胞中普遍表達的絲氨酸-蘇氨酸激酶，具有多種功能，其中包括對糖原代謝和轉錄過程的調節(jié)。最近Marchand等證明抑制GSK3可通過JNK-cJUN信號通路引起人胰腺癌細胞的凋亡。在此基礎之上，他們發(fā)現抑制GSK3可通過增強自噬/溶酶體網狀系統(tǒng)的活性來誘導促生存信號，制衡死亡信號。在胰腺癌細胞內，自噬溶酶體生物合成的主要轉錄調節(jié)因子、轉錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)均受GSK3的調控。類似于mTOR信號通路的抑制，GSK3抑制劑促進TFEB的核定位，通過內生絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶的活動導致TFEB的去磷酸化。然而，GSK3和mTOR信號通路的抑制對TFEB磷酸化的影響其機制和途徑是不同的，這表明TFEB受多種激酶和/或磷酸酶的調控。盡管對TFEB磷酸化的影響各異，GSK3和mTOR的抑制劑都可以促進14-3-3分離和TFEB的核定位。定量質譜分析進一步揭示了TFEB與依賴于GSK3和mTOR抑制劑的核蛋白的密切關聯，同時也表明它們對TFEB的轉錄調節(jié)功能具有積極的影響。最終，在成熟的胰腺癌細胞可見TFEB充分的核定位，而下調TFEB的表達量明顯破壞胰腺癌細胞在非錨泊性方式下的生長能力。此外，TFEB限制性細胞對GSK3抑制引起的凋亡更加敏感。以上研究結果除了提供GSK3對TFEB調控的關鍵證據外，還揭示了胰腺癌細胞中GSK3所調控的新功能。

J Biol Chem, 2015, 290(9):5592-5605(周 晗)

Comparison between single nucleotide polymorphism array and karyotyping in prenatal diagnosis in Down’s screening abnormal pregnancy

BAI Xiao-yi1, ZHANG Jun2, TIAN Qi2, LIN Jun-wei2, HOU Hong-ying1

(1DepartmentofObstetrics,2LaboratoryofObstetrics,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:gdgzhhyy@163.com)

AIM: To evaluate the clinical application of single nucleotide polymorphism array (SNP array) in prenatal diagnosis for screening the abnormality of women with Down’s syndrome (DS). METHODS: The amniotic fluid samples (n=312) collected by amniocentesis for the DS screening abnormality women were tested by karyotyping and SNP array analysis, respectively. The findings of karyotyping and SNP array analysis were compared. RESULTS: Two cases of trisomy 21 were identified by karyotyping and SNP array analysis, but SNP array analysis failed to identify 6 cases of chromosome balanced structural rearrangement. SNP detec ted 176 cases copy number variants (CNVs) in 303 cases normal karyotype were detected by SNP, including 106 benign CNVs, 61 variants of unknown significance (VOUS), 9denovoCNVs, and none of them was pathogenic. The distribution difference of CNVs in DS screening positive group and DS screening positive plus advanced maternal age group was not statistically significant (P>0.05). Furthermore, we reported 14 kinds of CNVs for the first time in population. CONCLUSION: SNP array can further assure chromosome microduplication/microdeletion. In normal karyotype fetus of prenatal diagnosis, SNP can detect some clinical significant CNVs.

Single nucleotide polymorphism array; Karyotyping; Copy number variants; Prenatal diagnosis

1000- 4718(2015)04- 0707- 06

2014- 12- 16

2015- 03- 12

廣東省科技計劃(No. 2009B060700107)； 中山大學達安基因股份有限公司廣州市醫(yī)學診斷技術和產品創(chuàng)新及應用協同創(chuàng)新重大專項合作費(No. 201400000004-4)

R714

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.024

△通訊作者 Tel: 020-85252172； E-mail: gdgzhhyy@163.com