宋勇戰(zhàn)， 錢明陽(yáng)， 李渝芬， 鐘詩(shī)龍， 劉寶龍， 歐艷秋， 張智偉△， 曾國(guó)洪△

(1廣東省心血管病研究所， 2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510100； 3南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 510515)

?

懷有先天性心臟病胎兒的孕婦與正常孕婦腸道菌群的高通量測(cè)序分析

宋勇戰(zhàn)1， 錢明陽(yáng)1， 李渝芬1， 鐘詩(shī)龍2， 劉寶龍3， 歐艷秋1， 張智偉1△， 曾國(guó)洪1△

(1廣東省心血管病研究所，2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510100；3南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 510515)

目的： 分析懷有先天性心臟病胎兒的孕婦(PW組)與正常孕婦(NW組)的腸道菌群特征。方法: 對(duì)可能引起個(gè)體腸道菌群差異的因素加以控制，2013年6月18號(hào)～2013年12月17號(hào)收集15例正常孕婦和17例異常孕婦的糞便樣本，提取細(xì)菌基因組DNA，用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA，進(jìn)行二代Illumina測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)應(yīng)用運(yùn)算分類單位(operational taxonomic unit，OTU)聚類分析、多樣性分析和分類學(xué)分析等生物信息技術(shù)分析2類孕婦腸道菌群的結(jié)構(gòu)、多樣性和豐度。結(jié)果: 2類孕婦腸道菌群的高通量測(cè)序分析分別得到2 696 276(NW組)條和2 445 530(PW組)條優(yōu)化序列，測(cè)序覆蓋深度>97%。經(jīng)過97%相似度歸并后分別得到77 243個(gè)(NW組)和75 600個(gè)OTUs(PW組)；菌群多樣性分析顯示正常孕婦腸道菌群的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于異常孕婦。在最佳分類水平上，正常孕婦腸道菌群由38個(gè)科的細(xì)菌構(gòu)成，歸屬于14個(gè)門，以厚壁菌門(Firmicutes)為主，其次為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等。懷有先心胎兒孕婦腸道菌群構(gòu)成與正常孕婦相似，最佳分類水平上由33個(gè)科的細(xì)菌構(gòu)成，歸屬于9個(gè)門，其中Firmicutes為(75.7±15.8)%，Proteobacteria為(21.1±17.0)%，Actinobacteria為(2.0±2.1)%。在最佳分類水平上，方差分析顯示兩者的雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)和紅蝽?xiàng)U菌科(Coriobacteriaceae)菌種豐度有明顯差異。結(jié)論: PW組孕婦與NW組孕婦相比，整體腸道菌群含量明顯下降，提示PW組孕婦有更惡劣的腸道環(huán)境，其中部分菌群含量存在明顯差異。先天性心臟病胎兒的發(fā)生可能與孕婦惡劣的腸道微環(huán)境有關(guān)，其中Bifidobacteriaceae和Coriobacteriaceae在先天性心臟病的預(yù)防方面可能有重要作用。

腸道菌群； Illumina測(cè)序； 雙歧桿菌科； 紅蝽?xiàng)U菌科； 先天性心臟病

腸道菌群被譽(yù)為是人體自身的黑匣子，一切的生命活動(dòng)和代謝情況，都可以從中窺見一斑[1]。已證實(shí)腸道菌群與人體過敏反應(yīng)、自身免疫病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、自閉癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等都有明確的關(guān)系[2]?？紤]到一切的外在因素最終都要通過母體影響胎兒的發(fā)育，被譽(yù)為人體另一器官、可導(dǎo)致機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)發(fā)病的腸道菌群，可能是其中一條途徑。借助宏基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)[3]，我們對(duì)15例正常孕婦與17例懷有先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)胎兒孕婦的腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，探討其結(jié)構(gòu)組成、菌群多樣性和豐度等各方面差異，旨在為先天性心臟病的早期預(yù)防、診斷和治療探索新的路徑。

材 料 和 方 法

1 樣本的收集

2013年6月18日～2013年12月17日在廣東省人民醫(yī)院心兒科收集17例懷有先天性心臟病胎兒孕婦的糞便標(biāo)本命名為PW組；在廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收集15例懷有正常胎兒孕婦的糞便標(biāo)本(在我院婦產(chǎn)科產(chǎn)檢未發(fā)現(xiàn)異常)命名為NW組。2組孕婦的基本情況見表1，孕前體重、身高和年齡經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，均沒有明顯差別(P>0.05)。所有入選孕婦要求近3個(gè)月之內(nèi)未使用過抗生素。樣本質(zhì)量≥5 g，放入無(wú)菌 EP 管中，做好標(biāo)記，-80 ℃冰箱凍存待用。采集和運(yùn)送樣本過程嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行。同時(shí)，參閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]，對(duì)可能引起菌群差異的其他相關(guān)因素進(jìn)行登記。懷有先天性心臟病胎兒孕婦的臨床診斷：所選標(biāo)本均為有明顯畸形，胎兒多為復(fù)雜先心，見圖1；單純病變僅限大室間隔缺損(缺損>5 mm)；小房間隔缺損、小動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、小室間隔缺損均排除，確保在診斷方面沒有問題(17例胎兒中，大室間隔缺損3例，復(fù)雜先心病14例)。懷有正常胎兒孕婦的臨床診斷為在廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)檢過程中未發(fā)現(xiàn)任何異常的病例。

表1 2組研究對(duì)象的一般資料

Figure 1.B-ultrasonography mode showing that the heart presences a huge atrial septal defect and a huge ventricular septal defect (A) and color Doppler ultrasound showing that the blood circulates randomly inside the heart (B).

圖1 二維切面及彩色多普勒切面顯示的胎兒復(fù)雜性先心病

2 腸道細(xì)菌宏基因組 DNA 的提取

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Tiangen)制備細(xì)菌DNA，按試劑盒說明書操作。

3 16s rDNA V4可變區(qū)的擴(kuò)增

所提取的DNA經(jīng)過NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)，所有樣品A260/A280比值均在 1.8～2.0之間。對(duì)合格的DNA樣品采用細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)通用引物(520F：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACA-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGATGC-TAYTGGGYDTAAAGNG-3’；5’-803R：CAAGCAGAA-GACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAG-ACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACCRGGGTATCTAATC-C-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 283 bp左右，引物交由廣州基迪奧生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL。

4 16S rDNA 宏基因組測(cè)序

PCR產(chǎn)物定量均一化后由基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。本次 32 個(gè)樣品，16S rDNA高變區(qū)測(cè)序所采用的測(cè)序策略為 Illumina系統(tǒng)的MiSeq平臺(tái)， PE250測(cè)序，V4 區(qū)域。

5 生物信息學(xué)分析

主要包括 (1) 數(shù)據(jù)過濾及拼接；(2) tags物種注釋；(3)運(yùn)算分類單位(operational taxonomic unit, OTU)與物種注釋；(4) 樣品的復(fù)雜度分析；(5) 多樣品比較分析等。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件，對(duì)年齡、身高、體重、OTU數(shù)量、分類種數(shù)計(jì)量資料進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 使用R語(yǔ)言對(duì)2組(正常與先心病)樣本的菌種豐度進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從短期形勢(shì)來(lái)看，在次貸危機(jī)過后，美國(guó)的經(jīng)濟(jì)出現(xiàn)復(fù)蘇乏力的態(tài)勢(shì)，存在失業(yè)率較高的問題，同時(shí)歐盟、日本以及中國(guó)、印度等新興國(guó)家也逐漸加大對(duì)科技創(chuàng)新的戰(zhàn)略部署，因此美國(guó)政府通過創(chuàng)新戰(zhàn)略進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)科技創(chuàng)新的重要性，開啟全民創(chuàng)新，提供高質(zhì)量就業(yè)崗位，以創(chuàng)新作為突破口緩解美國(guó)當(dāng)時(shí)的內(nèi)憂和外患[7]。

結(jié) 果

1 測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)

從懷有正常胎兒的孕婦樣品中，我們共獲得2 696 276優(yōu)化序列條，經(jīng)過97% 相似度歸并后得到77 243 個(gè)OTUs；從懷有先天性心臟病胎兒的孕婦樣品中，我們共獲得2 445 530條優(yōu)化序列。經(jīng)過97% 相似度歸并后得到75 600個(gè)OTUs，測(cè)序覆蓋深度大于0.97。繪制稀釋曲線(rarefaction curve)，大部分測(cè)序樣品未進(jìn)入平臺(tái)期，顯示隨著測(cè)序量的增加仍會(huì)有新的種系被發(fā)現(xiàn)，見圖2。

2 菌群多樣性分析

2類孕婦腸道菌群的多樣性指數(shù)如表2所示。2類樣本chao 1值和ACE值差別較大。NW組的chao 1平均值為(24 545.29±8 615.56)， ACE值為(56 171.10±28 316.01)，而PW組的 chao 1平均值為(15 707.10±4 066.74)和ACE值為(32 540.04±8 760.90)，顯示NW組孕婦腸道菌種豐度要高于PW組孕婦。

Figure 2.The rarefaction of different samples (97% similarity).

圖2 各樣品在97%相似度的稀釋曲線圖

Shannon、npShannon和Simpson這3個(gè)指數(shù)顯示兩組病人之間在菌群多樣性方面差異較小。Shannon曲線圖顯示所有樣本已進(jìn)入平臺(tái)期，隨測(cè)序深度增加樣品多樣性不會(huì)有明顯變化，見圖3。

3 物種分析

克隆序列經(jīng)過剪接加工整理，與16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)(Ribosomal Database Project, RDP)比對(duì)，鑒定微生物菌種?；诰T(phylum)級(jí)別分類及最佳分類水平菌科(family)級(jí)別分類，計(jì)算各樣品豐度。統(tǒng)計(jì)分析比較2組間菌種分布差異。

表 2 2組孕婦腸道菌群的多樣性指數(shù)

Table 2.The diversity indexes of the intestinal microbial flora from the pregnant women in the 2 groups

DiversityindexNWPWChao124545.29±8615.5615707.10±4066.74ACE56171.10±28316.0132540.04±8760.90Shannon3.91±0.523.54±0.64npShannon4.03±0.533.65±0.66Simpson0.06±0.030.10±0.07

討 論

先天性心臟病是指出生時(shí)即存在的心臟、血管結(jié)構(gòu)和功能上的異常。是由于各種原因引起的正常心臟、血管組織胚胎發(fā)育異常，或是胚胎早期停止發(fā)育引起。據(jù)統(tǒng)計(jì)，出生缺陷已逐漸成為我國(guó)圍生期兒死亡的主要原因，而先心病占據(jù)了主要出生缺陷疾病的1/3，是最常見的心臟病。最新調(diào)查統(tǒng)計(jì)表明，存活新生兒中先天性心臟病的發(fā)病率為0.6%～1.0%， 國(guó)內(nèi)最近調(diào)查北京市所有出生于 2007年間的新生兒，發(fā)現(xiàn)先天性心臟病的發(fā)病率為 0.82%，其中死產(chǎn)和活產(chǎn)嬰兒的發(fā)病率分別為 16.88%和0.67%[5]。雖然先天性心臟病的患病人數(shù)并不少，有關(guān)先天性心臟病病因的研究也有很多，但目前并沒有突破性的進(jìn)展。病因方面取得共識(shí)的主要有遺傳因素、環(huán)境因素及母體方面的因素。

Figure 3.The Shannon-Wiener curves.

圖3 Shannon指數(shù)圖

Figure 4.The main components of the gut microbiota in the 2 groups.

圖4 2組孕婦腸道菌群主要成分圖

既往對(duì)先天性心臟病病因的研究，各個(gè)中心、各個(gè)地區(qū)結(jié)論不一[6-9]，且很多為環(huán)境污染等不可控因素，但各種外在因素最終是如何引起胎兒發(fā)育畸形的并沒有相關(guān)研究。鑒于腸道菌群對(duì)人體各個(gè)系統(tǒng)的廣泛作用，我們篩選了2組孕婦對(duì)腸道菌群與先心病的關(guān)系做一初探。

本次研究通過對(duì)17例異常孕婦和15例正常孕婦進(jìn)行第2代高通量測(cè)序，共獲得2 696 276條優(yōu)化序列，分別得到75 600和77 243個(gè)OTUs，兩樣本的coverage 指數(shù)均在0.97 以上，測(cè)序深度合理。菌群多樣性分析顯示NW組的chaol值、ACE均明顯高于PW組，顯示正常孕婦腸道菌群各菌種豐度要高于懷有先心胎兒的孕婦，懷有先心胎兒的孕婦整體腸道菌群含量下降，有更為惡劣的腸道微環(huán)境。2組孕婦的Shannon、npShannon及Simpson指數(shù)差別不大，顯示兩者在菌群多樣性方面差異較小。

菌群組成方面,通過與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，門水平上，2組孕婦均以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門組成為主，占比達(dá)到98%以上，與以往報(bào)道正常人腸道菌群組成相似[10]。顯示人體腸道菌群有很好的穩(wěn)定性，懷孕并沒有引起腸道菌群的劇烈變化。最佳分類水平上，經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)，2組孕婦大部分菌科均無(wú)明顯差別，為人體腸道正常菌群，主要組成菌群也類似。但在雙歧桿菌科、紅蝽?xiàng)U菌科兩者含量存在明顯差別，雙歧桿菌科在NW組孕婦的豐度平均值為6.91%，在PW孕婦的平均值為1.48%；紅蝽?xiàng)U菌科在NW組孕婦的豐度平均值為4.76%，在PW組孕婦的豐度平均值為0.33%。NW組孕婦兩科細(xì)菌的含量要顯著高于PW組孕婦。

課題設(shè)計(jì)之初我們就考慮到個(gè)體因素可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，借鑒既往研究的經(jīng)驗(yàn)[4, 11-12]，我們盡量排除了一些混雜因素可能帶來(lái)的影響。病例選擇方面，懷孕之后絕大多數(shù)媽媽都會(huì)很注意自己的飲食起居，基本上也不會(huì)使用任何藥物。我們此次篩查的病例都為南方人，來(lái)自廣東、福建、湖南 3 省的常住人口，以廣東居多，飲食習(xí)慣較為類似；家庭收入方面，絕大部分家庭人均月收入在0.5萬(wàn)～1.2萬(wàn)之間，考慮到孕婦在家庭中的優(yōu)先權(quán)，經(jīng)濟(jì)原因?qū)е碌膮^(qū)別基本可以排除；極個(gè)別孕婦對(duì)飲食有特殊嗜好，由于擔(dān)心對(duì)胎兒的影響，也會(huì)有所節(jié)制；入選所有孕婦均沒有不良嗜好，不抽煙、不喝酒，沒有藥物濫用史，家族沒有先心病遺傳病史，沒有高血壓、糖尿病、乙肝等常見病，均為漢族，學(xué)歷以本科、大專居多，占比達(dá)到80%?？紤]到懷孕后孕婦基本以居家修養(yǎng)為主，孕婦的職業(yè)、戶口類型不作為影響因素。入選病例基本可以代表中國(guó)南方一名普通孕婦日常的生活狀況?；诖?，基本可以認(rèn)為雙歧桿菌科和紅蝽?xiàng)U菌科在2組孕婦中的差別為絕對(duì)差別。

由此我們得出的結(jié)論，懷有先心胎兒的的孕婦似乎有更惡劣的腸道微環(huán)境，整體菌群的豐度較正常孕婦有所下降。對(duì)于兩者存在明顯差異的兩類細(xì)菌，搜索文章發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌科、紅蝽?xiàng)U菌科均為腸道益生菌，參與人體的營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)、自身保護(hù)等各個(gè)環(huán)節(jié)[13]。尤其是雙歧桿菌，它的含量和種類的變化是腸道菌群穩(wěn)定與否的風(fēng)向標(biāo)[14]。其終生定植于人類腸道中且數(shù)量最占優(yōu)勢(shì)，決定著我們的身體健康甚至壽命的長(zhǎng)短。目前已認(rèn)識(shí)到與機(jī)體的免疫功能、衰老、腫瘤甚至一些慢性病，如冠心病等密切相關(guān)。但是對(duì)雙歧桿菌的研究滯后，認(rèn)識(shí)不足，也是目前學(xué)界的共識(shí)。至于孕婦腸道雙歧桿菌的變化對(duì)胎兒發(fā)育的影響，筆者搜索文章更是沒有報(bào)道。不過益生菌的顯著減少，可能就意味著無(wú)關(guān)菌群或者惡性菌群的增加，勢(shì)必會(huì)影響到孕婦很多的代謝過程，至于具體到對(duì)胎兒發(fā)育的影響，還有待后續(xù)的研究。

目前該結(jié)論的適用有一定的局限性，因?yàn)?組孕婦平均的確診時(shí)間都在28～29周左右，基本都在孕后期。一方面這是由于胎兒心血管系統(tǒng)發(fā)育成熟的時(shí)間所限，基本要在孕22周以后我們才能得到清晰可靠的超聲圖像；另一方面，對(duì)每一個(gè)懷疑有先心病的胎兒，我們至少要復(fù)查2次甚至多次才會(huì)確診。究竟在孕早期甚至懷孕之前是不是兩者已經(jīng)有腸道菌群的差異，是不是正是由于腸道菌群的普遍減少，才會(huì)引起先心胎兒的出現(xiàn)，又是什么原因引起2組孕婦腸道菌群的變化，通過補(bǔ)充益生菌能不能預(yù)防先心胎兒的出現(xiàn)這些問題的解答都有待于后續(xù)的研究，但可以肯定的是我們?yōu)橄刃牟〉念A(yù)防、診斷甚至治療探索到了一條新的路子。

[1] Cho I, Blaser MJ. The human microbiome: at the interface of health and disease[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13(4):260-270.

[2] 黃秀艷, 曾耀英. 腸道微生物群的病理生理學(xué)進(jìn)展[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(6):1127-1135.

[3] Floch MH. Intestinal microecology in health and wellness[J]. J Clin Gastroenterol, 2011, 45(Suppl):S108-S110.

[4] Liu S,Liu J, Tang J,et al. Environmental risk factors for congenital heart disease in the Shandong Peninsula, China: a hospital-based case-control study[J]. J Epidemiol, 2009, 19(3):122-130.

[5] Yang XY, Li XF, Lü XD, et al. Incidence of congenital heart disease in Beijing, China[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(10):1128-1132.

[6] Johnson PD, Goldberg SJ, Mays MZ, et al. Threshold of trichloroethylene contamination in maternal drinking waters affecting fetal heart development in the rat[J]. Environ Health Perspect, 2003, 111(3):289-292.

[7] Ritz B, Wilhelm M. Ambient air pollution and adverse birth outcomes: methodologic issues in an emerging field[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2008, 102(2):182-190.

[8] Hwang BF, Magnus P, Jaakkola JJ. Risk of specific birth defects in relation to chlorination and the amount of natural organic matter in the water supply[J]. Am J Epidemiol, 2002, 156(4):374-382.

[9] Malik S, Schecter A, Caughy M, et al. Effect of proximity to hazardous waste sites on the development of congenital heart disease[J]. Arch Environ Health, 2004, 59(4):177-181.

[10]Eckburg PB, Bik EM，Bernstein CN ,et al. Diversity of the human intestinal microbial flora[J]. Science, 2005, 308(5728):1635-1638.

[11]Walker A. A glut from the gut: metagenomics takes a giant step foward[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(5):315.

[12]Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography[J]. Nature, 2012, 486(7402):222-227.

[13]LeBlanc JG, Milani C, de Giori GS, et al. Bacteria as vitamin suppliers to their host: a gut microbiota perspective[J]. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(2):160-168.

[14]Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R ,et al. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(10):4506-4512.

Transcriptome characterization of intestinal microbial flora in different pregnant women using Illumina sequencing

SONG Yong-zhan1, QIAN Ming-yang1, LI Yu-fen1, ZHONG Shi-long2, LIU Bao-long3, OU Yan-qiu1, ZHANG Zhi-wei1, ZENG Guo-hong1

(1GuangdongCardiovascularInstitute，2GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalScience,Guangzhou510100,China;3GraduateSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:yong.zhan2008@163.com;drzhangzw@sohu.com)

AIM: To investigate the characteristics of the intestinal microbial flora in the pregnant women with congenital heart disease fetus (PW group) and normal pregnant women (NW group). METHODS: Stool samples were collected from 15 NW and 17 PW cases. The bacterial genomic DNA was extracted. The 16S rDNA was amplified by PCR, and the second generation of Illumina sequencing was conducted. RESULTS: We obtained 2 696 276 (NW group) and 2 445 530 (PW group) optimized sequences. The coverage was greater than 97%. We obtained 77 243 operational taxono-mic units (OTUs) in NW group and 75 600 OTUs in PW group after a 97% similarity merge. In NW group, the Chao 1 index and the Shannon index were greater than those in PW group. The diversity analysis of microbial population indicated that they were mainly composed ofFirmicutes,ProteobacteriaandActinobacteria. In family, theBifidobacteriaceaeandCoriobacteriaceaewere significantly different through analysis of variance. CONCLUSION: TheBifidobacteriaceaeandCoriobacteriaceaemay play an important role in the occurrence of congenital heart disease.

Intestinal microbial flora; Illumina sequencing;Bifidobacteriaceae;Coriobacteriaceae; Congenital heart disease

1000- 4718(2015)04- 0702- 05

2014- 11- 10

2015- 01- 21

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.023

△通訊作者 曾國(guó)洪 Tel: 020-83827812-10810; E-mail: yong.zhan2008@163.com; 張智偉 Tel: 020-83827812-10810; E-mail: drzhangzw@sohu.com