外源纖維分解酶對玉米秸預處理條件的篩選

趙麗媛，彭永佳，王佳堃，劉建新（浙江大學奶業(yè)科學研究所，浙江杭州310058）

外源纖維分解酶對玉米秸預處理條件的篩選

趙麗媛，彭永佳，王佳堃，劉建新*
（浙江大學奶業(yè)科學研究所，浙江杭州310058）

試驗首先篩選出促進玉米秸發(fā)酵的2種最佳酶制劑（試驗一），之后分析2種酶制劑的最適預處理時間（試驗二）和溫度（試驗三）。試驗一采用單因素試驗設計，包括4種纖維素酶（CEL）和4種木聚糖酶（XYL）。試驗二和試驗三采用二因素試驗設計，包括對照組、纖維素酶組和木聚糖酶組3組，其中試驗二設3個預處理時間（0、12、24 h），試驗三設4個預處理溫度（4℃、15℃、25℃、39℃）。利用壓力讀取式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)，測定產(chǎn)氣量（GP）、干物質（DM）、中性洗滌纖維（NDF）及酸性洗滌纖維（ADF）降解率。結果表明：CEL2和XYL1顯著提高玉米秸纖維降解率；預處理24 h的GP、DM、NDF和ADF降解率顯著高于0 h和12 h（P＜0.01），XYL和CEL處理顯著提高GP和DM降解率（P＜0.05），預處理時間與酶之間沒有互作效應（P＞0.05）；GP、DM和ADF降解率以39℃最高（P＜0.01），NDF降解率以25℃最高（P＜0.01），XYL和CEL處理顯著提高GP和ADF降解率（P＜0.05），預處理溫度與酶對DM和NDF降解率有顯著互作效應（P＜0.01）。結果提示，25℃以上預處理24 h，酶制劑預處理玉米秸效果最佳。

纖維分解酶；預處理；玉米秸；纖維降解

2010年我國玉米秸總產(chǎn)量達2.65億t［1］，而用于動物飼料的不足30%，不少在田間焚燒，造成資源極大浪費的同時引起環(huán)境的嚴重污染。玉米秸的纖維含量高和適口性差是制約其用于動物飼料的主要原因。近年來有研究表明，外源纖維分解酶能夠改善纖維消化率，其中以纖維素酶（CEL）和木聚糖酶（XYL）應用最為廣泛［2］。

酶的作用效果受到多種因素影響。首先酶對底物具有高度的專一性，要充分發(fā)揮酶制劑的作用，就應根據(jù)日糧搭配相應的酶制劑。因此，選擇與玉米秸發(fā)酵最適合的纖維酶是獲得最佳處理效果的基礎。同時，由于酶解產(chǎn)物達到一定濃度后會對反應過程產(chǎn)生反饋抑制作用，所以合適的催化反應時間也是確保酶發(fā)揮高效作用的因素。研究證明，CEL和XYL預處理24 h可以提高青貯玉米和稻草的體外干物質降解率（DMD）和中性洗滌纖維降解率（NDFD）［3-4］，Holtshausen等［5］發(fā)現(xiàn)使用液態(tài)酶預處理22 h可顯著提高苜蓿干草DMD和NDFD，Eun等［6］也發(fā)現(xiàn)CEL和XYL預處理18 h可顯著提高苜蓿干草體外產(chǎn)氣量和有機物降解率，由此可知一定的預處理時間對發(fā)揮酶的作用效果很重要。另外，溫度也是影響酶作用效果的重要因素，很多研究采用39℃作為預處理溫度［3-4］，也有在室溫條件下進行［5-6］，發(fā)現(xiàn)都可有效改善飼料纖維消化率。Colombatto等［7］提出，溫度對酶的效果沒有顯著影響，這提示預處理溫度的高低可能對酶發(fā)揮作用沒有影響，但是并沒有涉及低于室溫的預處理溫度對酶作用效果影響的研究。因此，關于酶制劑在應用時的預處理條件值得進一步研究。

目前，我國的養(yǎng)殖戶往往依據(jù)商家建議的添加劑量和方法使用酶制劑，并沒有考慮不同地區(qū)各個季節(jié)的環(huán)境溫度變化以及酶處理時間等決定性因素的影響，在酶制劑使用效果上就會出現(xiàn)效果差甚至沒作用的情況，從而造成經(jīng)濟損失。針對這個問題，本試驗利用體外產(chǎn)氣法，以玉米秸為底物，首先在實驗室前期預處理條件下對8種酶制劑進行初步篩選，之后針對不同時間和不同溫度預處理對CEL和XYL作用效果進行研究，為深入探索酶制劑的作用與生產(chǎn)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 底物玉米秸采集自河北邢臺地區(qū)，秋季收獲。65℃烘干制備風干樣，經(jīng)小型粉碎機40目粉碎，干物質（DM）、粗蛋白（CP）含量按《飼料分析及飼料質量檢測技術》方法測定，中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）按Van Soest法測定［8］。

1.2 酶活性和蛋白濃度測定選用的CEL和XYL分別來自于不同酶制劑供應商，模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境，在pH 6.6和溫度39℃條件下首先以葡萄糖、木糖為底物繪制標準曲線，再分別以羧甲基纖維素鈉、纖維素、燕麥木聚糖為底物測定酶的內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活［9-10］。使用Bradford蛋白定量試劑盒測定酶制劑的蛋白質濃度。測得的酶活和蛋白濃度見表1。

表1 酶制劑酶活性和蛋白濃度

1.3 試驗設計

1.3.1 最佳外源纖維分解酶的篩選（試驗一）采用單因素試驗設計，以玉米秸為底物，通過體外產(chǎn)氣法從8種酶制劑中篩選出最佳纖維素酶和木聚糖酶各一種，其中對照組不添加酶制劑，CEL和XYL添加水平分別為30 U/g DM和60 U/g DM［3-4］。

1.3.2 不同預處理時間的效果（試驗二）采用3×3二因素試驗設計，因素一為處理時間（0 h、12 h和24 h），因素二為酶處理組（對照組CON、纖維素酶組CEL和木聚糖酶組XYL），預處理溫度為39℃，CEL和XYL添加水平同上，探究不同預處理時間對玉米秸降解率的影響。

1.3.3 不同預處理溫度的效果（試驗三）采用4×3二因素試驗設計，考慮生產(chǎn)中的實際條件，因素一為處理溫度（4℃、15℃、25℃和39℃），分別模擬四季的溫度，因素二同上，預處理時間依試驗一結果，探究不同預處理溫度對玉米秸降解率的影響。

1.4 體外培養(yǎng)程序采用壓力讀取式體外產(chǎn)氣法（RPT系統(tǒng)），使用產(chǎn)氣瓶模擬體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)［11］。準確稱取0.5 g玉米秸（DM基礎）至恒重的ANKOM bag（F57，ANKOM Technology）中，熱封口后放入120 mL產(chǎn)氣瓶中，在持續(xù)通入CO2氣流下依次加入提前稀釋好的外源酶溶液200 μL和40 mL人工唾液［12］，用橡膠塞密封。依據(jù)試驗設計進行處理。

次日早晨選取3只體況良好，裝有永久瘤胃瘺管的湖羊作為瘤胃液供體。晨飼前經(jīng)瘤胃瘺管抽取瘤胃液，后經(jīng)滅菌的四層紗布過濾，準確抽取10 mL瘤胃液接種到產(chǎn)氣瓶中，混勻后，于39℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，整個過程保證無氧。試驗重復3次，每次設不加底物的空白組和標準羊草對照，以消除發(fā)酵液自身產(chǎn)氣以及不同批次引起的差異，每個處理設4個重復。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 pH發(fā)酵48 h后終止培養(yǎng)，立即使用SartoriusPB-20型pH計測定發(fā)酵液pH值。

1.5.2 產(chǎn)氣量（GP）分別記錄培養(yǎng)12、24 h和48 h后的壓力值，根據(jù)下列公式將產(chǎn)氣壓力轉換成產(chǎn)氣量［11］：

其中，GPt為底物在t時間段的產(chǎn)氣量（mL/g），Pt為t時間段壓力值（mPa），V0為產(chǎn)氣瓶的體積（mL），101.3為標準大氣壓（mPa），W為底物干物質重（g）。

48 h產(chǎn)氣量為各時間段產(chǎn)氣量之和。由于預處理階段底物降解也產(chǎn)生氣體，因此預處理期間的產(chǎn)氣量也計入總產(chǎn)氣量。

1.5.3 體外降解率發(fā)酵終止后，取出產(chǎn)氣瓶中ANKOM bag，清水洗滌至無色，65℃烘干48 h至風干樣，測定殘渣DM、NDF、ADF含量，按照下列公式計算底物DMD、NDFD和酸性洗滌纖維降解率（ADFD）。

1.6 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件統(tǒng)計處理，采用單因素、二因素方差分析，Duncan′s法進行多重比較。

2 結果

2.18 種酶制劑對玉米秸體外發(fā)酵降解率的影響由表2可知，與對照相相比，CEL 2和XYL 1極顯著提高了DMD（P＜0.01），CEL2、CEL 4、XYL 1極顯著提高了NDFD（P＜0.01），CEL 1、2、4和XYL 1、3、4極顯著提高了ADFD（P＜0.01）。其中CEL2和XYL1分別比對照組的DMD、NDFD和ADFD提高了3.2%、5.3%、5.9%和3.7%、3.0%、4.2%。

表28 種酶制劑對玉米秸稈體外發(fā)酵DMD、NDFD、ADFD的影響

2.2 預處理時間對體外玉米秸產(chǎn)氣量、降解率的影響由表3可知，各處理組瘤胃發(fā)酵液pH值沒有差異（P＞0.05），且均處在正常范圍內(nèi)。預處理時間對產(chǎn)氣量和降解率均有顯著影響（P＜0.05），預處理24 h的GP、DM、NDF和ADF降解率顯著高于0 h和12 h（P＜0.01），預處理12 h的ADF降解率顯著高于0 h（P＜0.05）；不同酶處理間的產(chǎn)氣量和降解率差異顯著（P＜0.05），XYL與CEL處理的GP、DM降解率均顯著高于對照組（P＜0.05），但2個酶之間沒有差異（P＞0.05）。NDF和ADF降解率，XYL顯著高于CEL，并顯著高于對照組（P＜0.05），但預處理時間與酶之間沒有互作效應（P＞0.05）。

2.3 預處理溫度對體外玉米秸產(chǎn)氣量、降解率的影響由表4可知，各處理組瘤胃發(fā)酵液pH值沒有差異（P＞0.05），且均處在正常范圍內(nèi)。預處理溫度對產(chǎn)氣量和降解率均有顯著影響（P＜0.05），GP、DM和 ADF降解率以39℃預處理最高（P＜0.01），NDF降解率以25℃預處理最高（P＜0.01）；而對于GP和DM降解率，4℃與15℃、25℃之間差異不顯著（P＞0.05）。不同酶處理間的產(chǎn)氣量和降解率差異顯著（P＜0.05），XYL或CEL處理后的GP、ADF降解率均顯著高于對照組（P＜0.05），但2個酶之間沒有差異（P＞0.05）；對于DM降解率，XYL顯著高于對照組（P＜0.05），而XYL處理的NDF降解率顯著高于CEL處理（P＜0.05）。預處理溫度與酶對DM和NDF降解率有顯著的互作效應（P＜0.01）。

表3 預處理時間對玉米秸48h產(chǎn)氣量、干物質與纖維物質降解率的影響

表4 預處理溫度對玉米秸48 h產(chǎn)氣量、干物質與纖維物質降解率的影響

3 討論

粗飼料是反芻動物的主體飼料，其降解率為體外發(fā)酵最主要篩選指標。在體外培養(yǎng)前對底物進行酶液預處理，酶可以在進入瘤胃之前發(fā)揮一定作用，破壞纖維物質結構，提高底物消化率［13］，這種作用相當于在飼喂動物前對飼料進行預處理；同時，酶能與底物之間形成穩(wěn)定的底物-酶復合物，減緩酶被瘤胃蛋白酶的降解作用［14］。本試驗就預處理時間與溫度進行研究，試圖獲得理想的預處理條件。

3.1 玉米秸發(fā)酵最適纖維酶酶和底物之間存在特異性，不同來源的酶制劑對不同飼料底物的作用效果不一致。本實驗室之前以玉米青貯和稻草為底物，已經(jīng)篩選出纖維降解能力較強的4種纖維素酶和4種木聚糖酶，酶的最佳添加劑量分別為30、60 U/g DM［3-4］。在前期工作的基礎上，本試驗將這8種酶作為候選酶，首先篩選出最適合玉米秸發(fā)酵的纖維分解酶。結果表明，CEL2和XYL1對玉米秸NDF和ADF的降解率均有最佳的增加效果。有研究指出，體外試驗中NDFD提高1%可以引起體內(nèi)試驗中奶牛DMI增加0.17 kg，4%FCM產(chǎn)量增加0.25 kg［15］。提示以NDFD評價纖維酶作用效果對實際生產(chǎn)具有一定指導意義。本試驗選擇CEL2和XYL1進行預處理時間和溫度的后續(xù)研究，為這兩種纖維素酶在不同環(huán)境條件下的應用提供理論支撐。

3.2 預處理時間Díaz等［16］使用纖維素酶預處理6種熱帶粗飼料24 h后，發(fā)現(xiàn)底物有機物消化率顯著提高，其中4種粗飼料的NDF降解率顯著提高。Llewellyn等［17］發(fā)現(xiàn)，使用商業(yè)酶預處理雀麥草、小麥稈等纖維類粗飼料24 h可顯著提高其DM降解率。Eun等［18］發(fā)現(xiàn)，用酶預處理粗飼料20 h可以提高其消化水平，一定程度改變其纖維結構，促進瘤胃微生物對底物的附著與分解。Beauchemin等［14］的研究也強調(diào)了酶吸附作用的重要性，指出在飼喂前將酶處理飼料，可以促進酶與底物的吸附從而保護酶在瘤胃中不被降解以達到酶作用發(fā)揮最大化。本試驗得到了相似的結果，用外源纖維分解酶預處理玉米秸可以改善其DM和纖維物質降解，應該也是基于這一機理。本研究結果表明一定的預處理時間是提高外源酶添加效果的有效途徑。

3.3 預處理溫度以往報道關于預處理溫度對酶的效果不盡一致。Giraldo等［19］報道，在室溫條件下預處理含70%干草的高粗料日糧可以顯著降低其NDF含量。Schroye等［20］在30℃預處理玉米秸，可有效破壞其木質素結構為易分解的小分子固體顆粒。Yang等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，在39℃時用多種纖維分解酶預處理玉米秸可潛在提高其纖維降解率。本研究表明，隨著溫度的升高，底物DM、NDF和ADF降解率在數(shù)值上逐步增加，可見保證適宜的預處理溫度（至少在室溫以上）是維持酶高效作用的基礎，同時可以更好地實現(xiàn)飼料能量釋放和經(jīng)濟效益最大化。

值得一提的是，在本研究中單個預處理溫度條件下，酶添加組與空白對照組的產(chǎn)氣量相比只有數(shù)值上的增加，在統(tǒng)計上沒有顯著差異，卻顯著提高了底物降解率，這在一定程度說明產(chǎn)氣量和底物降解率不存在正相關關系，與Menke等［12］報道不一致。此外，由統(tǒng)計結果顯示，木聚糖的效果整體優(yōu)于纖維素酶。提示對于玉米秸來說，本研究選用的CEL可能不是最佳的酶制劑，這和不同的酶與底物之間的特異性有關，有待進一步研究。

4 結論

本研究通過比較兩種最佳外源酶制劑在不同預處理時間及溫度條件下對玉米秸的纖維降解情況，發(fā)現(xiàn)將溫度控制在室溫以上并保持足夠的預處理時間是酶發(fā)揮最大作用的適宜條件。綜合結果表明，外源酶制劑預處理玉米秸的最優(yōu)條件為25℃以上預處理24 h。

致謝：感謝國際原子能機構（IAEA）對本試驗的支持，感謝浙江大學奶業(yè)科學研究所老師、同學對本試驗的幫助。

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OptimalPretreatment Condition for Exogenous Fibrolytic Enzyme on Corn Stover

ZHAO Li-yuan，PENG Yong-jia，WANG Jia-kun，LIU Jian-xin*
（Institute of Dairy Science，Zhejiang University，Zhejiang Hangzhou 310058，China）

The objective of this study was to screen one cellulose（CEL）and one xylanase（XYL）（Trial 1），and evaluate the effects of pretreatment times（Trial 1）and temperatures（Trial 2）forthese two enzymes on corn stover.Trial 1 was conducted according to single factorial design，including 4 CELs and 4 XYLs.Trial 2 and trial 3 were conducted according to a two-way factorial design.Trial 2 involved 3 pretreatment times（0，12 and 24 h）and Trial 2 involved 4 pretreatment temperatures（4，15，25 and 39℃），both trials included 3 enzyme treatments：corn straw as basal substrate without enzyme（CON）or treated with cellulase（CEL）or xylanase（XYL）.In vitro gas test（reading pressure technique）was then employed to determine gas production（GP）and degradation of dry matter（DM），neutral detergent fiber（NDF）and acid detergent fiber（ADF）after 48 h of incubation.CEL2 and XYL1 was screened out according to improved fiber digestion.Compare with pretreatment for 0 or 12 h，pretreatmentfor 24 h significantly increased the GPand degradability of DM，NDF and ADF（P＜0.01），higher value for XYL and CEL on GP and degradability of DM than that of CON（P＜0.05），with no interaction between pretreatment time and enzyme（P＞0.05）.When pretreated at 39℃，GP and degradation of DMand ADF degradation were significantly higher than that of 4，15 or 25℃（P＜0.01），with the highest NDF degradation at 25℃（P＜0.01）.XYL and CEL increased the GP and ADFdegradation（P＜0.05），with significant interactive effects between pretreatment temperature and enzyme on DM and NDF degradation（P＜0.01）.From the above results，it is inferred that corn stover should be pretreated at above 25℃for 24 h in order to obtain an optimal effect from enzyme treatment.

fibrolytic enzyme；pretreatment；corn stover；fiber degradation

S816.9

：A

：0258-7033（2015）19-0049-05

2015-01-22；

2015-04-26

國際原子能機構合作項目

趙麗媛（1988-），女，河北承德人，碩士生，從事反芻動物營養(yǎng)研究，E-mail：zhaoliyuanjuliet@163.com

*通訊作者：劉建新，教授，博士生導師，E-mail：liujx@zju.edu.cn