多角度分析P.ostreatus改性對玉米秸厭氧消化產(chǎn)氣性能的影響

黃文博，袁海榮，李秀金

（北京化工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，北京100029）

0 引言

以玉米秸為原料，通過厭氧消化技術(shù)生產(chǎn)甲烷是一種高效的可再生能源生產(chǎn)方式[1]。玉米秸的纖維素和半纖維素含量達(dá)55.0%～75.0%，具有很高的甲烷轉(zhuǎn)化潛力[2]。由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的復(fù)雜交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成的生物質(zhì)抗降解屏障具有一定的疏水作用，阻礙了厭氧微生物對纖維素和半纖維素的利用，尤其是影響水解階段纖維素酶和木聚糖酶在秸稈上的吸附和反應(yīng)[2]。為提高玉米秸的厭氧消化性能，須對其進(jìn)行改性處理。

白腐菌能通過木質(zhì)素氧化酶系統(tǒng)對木質(zhì)素進(jìn)行高效降解，提高秸稈的可利用性[3]。P.ostreatus是可食用白腐菌，除了對木質(zhì)素具有高效降解性外，對纖維素和半纖維素也具有降解能力，以提供自身生長所需的營養(yǎng)。劉紅菊研究了P.ostreatus對麥秸木質(zhì)纖維素的降解效果，結(jié)果顯示，預(yù)處理10 d的麥秸木質(zhì)素含量降低43.8%，纖維素含量提高37.2%[4]。Mustafa使用P.ostreatus預(yù)處理稻草20 d，木質(zhì)素降解率為33.4%，纖維素與半纖維素的降解率分別只為7.9%和16.9%[5]。由此可見，P.ostreatus能夠明顯降解秸稈中的木質(zhì)素，對纖維素和半纖維素的降解程度較低，提高了它們的可利用性。以往研究表明，經(jīng)P.ostreatus改性后的木質(zhì)纖維類底物的乙醇和甲烷轉(zhuǎn)化率均有所提高。Worfa研究了不同P.ostreatus改性時(shí)間對木薯乙醇產(chǎn)率的影響，結(jié)果顯示，改性1周的木薯可發(fā)酵糖得率最高為34.1g/L，乙醇產(chǎn)率較對照組提高35.0%左右[6]。Kainthola對P.ostreatus改性5周的稻草進(jìn)行厭氧消化，甲烷產(chǎn)率提高至對照組的1.6倍[7]。

P.ostreatus的生長過程分為菌絲生長、原基形成和子實(shí)體分化3個(gè)階段。P.ostreatus在不同生長階段中，對木質(zhì)纖維素的降解能力不同，因此，經(jīng)過不同P.ostreatus改性時(shí)間的玉米秸的酶水解性和甲烷產(chǎn)率也有明顯差異[8]。Worfa將P.ostreatus對木薯的改性時(shí)間由1周延長至2～8周，木薯發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化率降低[6]。已有研究認(rèn)為，延長白腐菌改性時(shí)間，使纖維素和半纖維素的消耗增加是影響乙醇或甲烷轉(zhuǎn)化的主要原因[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，菌絲穿透可以提高秸稈的孔隙度和表面積，從而提高改性秸稈的酶吸附性和反應(yīng)性，但隨著白腐菌生長時(shí)間的延長，菌絲蛋白在秸稈表面的附著又會阻礙酶對秸稈的接觸[9]。因此，須要對不同P.ostreatus改性時(shí)間的玉米秸的酶吸附、酶水解和甲烷轉(zhuǎn)化進(jìn)行多角度分析，研究各因素間的關(guān)聯(lián)性，通過機(jī)理分析，確定最佳的改性時(shí)間。

本文采用P.ostreatus對玉米秸進(jìn)行45 d改性試驗(yàn)，通過動力學(xué)模型擬合，量化改性參數(shù)，對不同改性時(shí)間的玉米秸的木質(zhì)纖維素降解、酶吸附、酶水解和甲烷轉(zhuǎn)化性能的變化進(jìn)行多視角綜合分析，探究提高玉米秸厭氧消化產(chǎn)氣性能的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用菌種P.ostreatus購自黑龍江省科學(xué)院微生物研究所。玉米秸取自北京市延慶區(qū)，將其風(fēng)干粉碎至20目備用。接種物為北京順義區(qū)某中溫沼氣站消化殘余物，發(fā)酵原料為豬糞。原料和接種物基本性質(zhì)示于表1。

表1 玉米秸及接種物基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of corn stover and inoculum

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）P.ostreatus改性

將360 g（以TS計(jì)）玉米秸置于17 cm×33 cm×5 cm的聚丙烯塑料薄膜袋中；以玉米秸∶石膏=99∶1配比混合均勻；用純水調(diào)節(jié)至含水率為65%，pH值為6～7；121℃高壓蒸汽滅菌1 h。滅菌原料接種P.ostreatus，接種量（W菌種/W原料）為10%。將接種后的玉米秸置于恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為28℃、濕度為85%～90%條件下進(jìn)行45 d改性處理。

在45 d改性周期中，每間隔5 d取樣，測定玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶的吸附性和水解性。通過動力學(xué)分析，表征改性玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶的可及性和反應(yīng)性。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）厭氧消化

以不同改性時(shí)間的玉米秸為試驗(yàn)組，以未改性的玉米秸為對照組，只添加接種物為空白組，進(jìn)行甲烷潛力（BMP）測定。反應(yīng)器工作體積300 mL，頂空體積200mL（圖1）。玉米秸有機(jī)負(fù)荷為4 g/L（以VS計(jì)），接種污泥有機(jī)負(fù)荷為8 g/L（以VS計(jì)），pH為7.0±0.2。在35±2℃下厭氧消化45 d。實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白組均設(shè)3組重復(fù)。

圖1 甲烷潛力測定實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Schematic diagram of BMP test device

1.3 分析方法

（1）基本性質(zhì)測定

根據(jù)APHA測定總固體含量（TS）及揮發(fā)性固體含量（VS）[10]。采用元素分析儀測定有機(jī)元素含量（TC，TH，TO及TN）。采用pH計(jì)測定pH值。采用全自動纖維分析儀測定木質(zhì)纖維素含量。采用排水法測定厭氧消化過程產(chǎn)氣量（標(biāo)況下計(jì)算）。采用氣相色譜測定所得氣體組分含量。

（2）酶吸附性能測定

纖維素酶吸附性能的測定方法：在檸檬酸鈉緩沖溶液（0.05M，pH 4.8）中加入2.5%改性玉米秸，纖維素酶濃度為10 FPU/g，在4℃條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品以4 000 r/min離心15min，采用Bradford法測定反應(yīng)前后上清液中蛋白質(zhì)含量的變化[11]。根據(jù)公式（1）計(jì)算纖維素酶吸附率。采用相同方法測定木聚糖酶，木聚糖酶添加量為20 IU/g。

式中：A為初始酶添加量，mg；B為上清液中未吸附酶量，mg。

（3）酶水解性能分析

參照文獻(xiàn)[8]，[12]所用的方法對改性玉米秸的纖維素酶及木聚糖酶水解率進(jìn)行測定。根據(jù)式（2），（3）計(jì)算酶水解率：

通過Nidetzky和Ohmine動力學(xué)模型，分析改性玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶的反應(yīng)性以及反應(yīng)速率的影響，如式（4）和（5）所示[13]。

式中：Y為不同水解時(shí)間的纖維素酶或木聚糖酶水解率，%；t為水解時(shí)間，h；P為玉米秸初始纖維素或半纖維素含量，%；K為達(dá)到最大纖維素或半纖維素水解量一半所需時(shí)間，h。

（4）厭氧消化動力學(xué)分析

利用BMP甲烷產(chǎn)率可擬合分析一級動力學(xué)厭氧消化產(chǎn)氣性能，擬合方程如式（6）所示[14]。

式中：BMP（t）為以VS計(jì)甲烷產(chǎn)率，mL/g；BMPmax為最大產(chǎn)甲烷潛力（以VS計(jì)），mL/g；k為以VS計(jì)的甲烷轉(zhuǎn)化速率常數(shù)，mL/（g·d）；θ為延滯期，d。

玉米秸有機(jī)組分采用概化分子式CnHaOb表示[14]。理論甲烷產(chǎn)量是當(dāng)?shù)孜锿耆D(zhuǎn)化成甲烷時(shí)的最大體積（標(biāo)況）。玉米秸的理論甲烷產(chǎn)量和生物降解性可由式（7）和式（8）得到。

式中：BD為生物降解性，%；BMP0為理論甲烷產(chǎn)率（以VS計(jì)），mL/g；BMPexp為實(shí)驗(yàn)所得甲烷產(chǎn)率（以VS計(jì)），mL/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶吸附性能的影響

圖2給出了改性玉米秸纖維素酶、木聚糖酶吸附曲線、木質(zhì)纖維素降解率及降解擬合曲線。

圖2 改性玉米秸纖維素酶、木聚糖酶吸附曲線、木質(zhì)纖維素降解率及降解擬合曲線Fig.2 Enzymes adsorption capacity，degradation ratio and liner fit for lignocellulose of the corn stovermodified by P.ostreatus

圖2（a）為不同改性時(shí)間的玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶吸附率的變化。結(jié)果顯示，改性5～25 d的玉米秸對兩種酶的吸附率隨著改性時(shí)間的延長而上升。改性25～35 d的玉米秸對纖維素酶的吸附率仍隨時(shí)間的延長而上升，但改性35～45 d上升趨勢停止，對木聚糖酶吸附率隨時(shí)間延長而降低。經(jīng)過25 d改性后，玉米秸對纖維素酶的吸附率提高19.3%。改性45 d后，玉米秸對纖維素酶的吸附率提高42.5%。這表明P.ostreatus改性能夠明顯提高玉米秸對纖維素酶的吸附率。文獻(xiàn)[15]的研究表明，纖維素酶是通過與秸稈纖維疏水基團(tuán)結(jié)合而附著在纖維表面，木質(zhì)素和半纖維素均含有疏水基團(tuán)，能夠吸附纖維素酶，干擾纖維素對纖維素酶的吸附。因此，須要結(jié)合改性玉米秸木質(zhì)纖維素降解情況，進(jìn)一步分析改性玉米秸對纖維素酶吸附的有效性。

圖2（b）為不同改性時(shí)間下P.ostreatus對玉米秸的木質(zhì)纖維素降解率。由圖2（b）可以看出，木質(zhì)素和半纖維素降解率始終高于纖維素。玉米秸初始木質(zhì)素和半纖維素含量低于纖維素，隨著改性時(shí)間延長，木質(zhì)素和半纖維素不斷減少，對纖維素酶的吸附減少，因此，纖維素對纖維素酶特異性吸附提高。改性30 d后，纖維素降解率達(dá)到20.5%，改性玉米秸的纖維素含量較低，對纖維素酶的吸附無法進(jìn)一步提高。

木聚糖是半纖維素的主要組成部分，木聚糖酶的吸附性能對半纖維素的降解效果具有主要影響。由圖2（a）可以看出，改性25 d的玉米秸對木聚糖酶吸附率提高21.0%，但改性時(shí)間超過30 d后吸附率降低了43.6%，表示部分吸附的木聚糖酶發(fā)生脫附，但殘余木聚糖酶繼續(xù)催化半纖維素水解，半纖維素降解率持續(xù)提高。

對不同階段半纖維素降解速率進(jìn)行線性擬合，如圖2（c）所示。如圖2（c）所示，改性處理30 d后，半纖維素降解速率降低，表明木聚糖酶吸附性降低對半纖維素的降解產(chǎn)生了影響。此外，Noori和Karimi研究認(rèn)為，木聚糖是維持秸稈持水性的主要物質(zhì)，而酶的吸附與秸稈持水性相關(guān)[15]。因此，隨著半纖維素的降解，木聚糖酶的吸附性也受到影響。綜上所述，改性25 d的玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶的吸附效果最佳。

2.2 改性玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶水解性能的影響

酶水解性可以定量分析不同改性時(shí)間的玉米秸中纖維素和半纖維素對纖維素酶和木聚糖酶的可及性和反應(yīng)性。圖3所示為改性玉米秸纖維素酶水解二級反應(yīng)模型擬合曲線及動力學(xué)參數(shù)。圖中c-0，c-5，c-10，c-15，c-20，c-25，c-30，c-1 flush，c-2 flush分別表示經(jīng)P.ostreatus改性0，5，10，15，20，25，30，35，45 d的玉米秸。

圖3 改性玉米秸纖維素酶水解二級反應(yīng)模型擬合曲線及動力學(xué)參數(shù)Fig.3 Nidetzky and Ohminemodel and kinetics parameter of cellulase hydrolysis of corn stovermodified by P.ostreatus

不同改性時(shí)間的玉米秸在不同水解時(shí)間下的纖維素酶水解率如圖3所示。由圖3（a），（c）可以看出，0～24 h改性玉米秸稈的纖維素酶水解率快速上升，120 h后水解達(dá)到平衡。對不同改性時(shí)間玉米秸的纖維素酶水解率分析結(jié)果表明，改性5～45 d的玉米秸纖維素酶水解率先上升后降低。其中，改性25 d的玉米秸纖維素酶水解率最高，較對照組提高12.9%。這可能是因?yàn)樵诟男郧?5 d，玉米秸對纖維素酶的吸附率提高明顯，促進(jìn)了對纖維素的水解。改性35～45 d的玉米秸稈對纖維素酶吸附率的提高趨于停止；在此階段玉米秸的纖維素含量相較初始含量降低了36.0%，纖維素酶可催化水解反應(yīng)的纖維素減少，導(dǎo)致最終纖維素水解率比對照組降低了2.3%。

Nidetzky纖維素酶水解模型擬合曲線如圖3（a）所示，擬合獲得的纖維素酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)P如圖3（b）所示。P值表示底物對纖維素酶的反應(yīng)性，K值表示達(dá)到最大纖維素水解率一半時(shí)的水解時(shí)間。隨著改性時(shí)間的延長，玉米秸P值先增大后減小。改性25 d的玉米秸P值最大，為33.0%，較對照組提高18.7%，表明改性25 d的玉米秸對纖維素酶的反應(yīng)性最高。改性45 d的玉米秸P值與對照組差異不顯著（p＞0.05），表明延長改性時(shí)間使玉米秸的水解性能降低。K值隨改性時(shí)間的延長也呈先上升后下降趨勢，且改性玉米秸K值是對照組K值的1.9～3.3倍，表明改性玉米秸對纖維素酶的反應(yīng)速率的影響更小，水解反應(yīng)更穩(wěn)定。

圖3（c）為Ohmine纖維素酶水解模型擬合曲線，圖3（d）為擬合獲得的纖維素酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)酶水解反應(yīng)初始速率ν0和酶在秸稈上的失活速率k。結(jié)果顯示，改性5～25 d的玉米秸稈ν0低于對照組，改性30～45 d的玉米秸稈ν0與對照組相近，表明纖維素酶在改性玉米秸上的初始反應(yīng)速率降低。改性玉米秸的k值隨改性時(shí)間的延長先降低后增高，改性25 d的玉米秸k值最小，為0.16，表明在水解過程中，纖維素酶在改性25 d的玉米秸上失活速率最低，水解持續(xù)時(shí)間最長。

采用相同模型對木聚糖酶水解率進(jìn)行擬合的結(jié)果如圖4所示。圖4中c-0，c-5，c-10，c-15，c-20，c-25，c-30，c-1flush，c-2flush分別表示經(jīng)P.ostreatus改性0，5，10，15，20，25，30，35，45 d的玉米秸。結(jié)果顯示，水解120 h后木聚糖酶水解率仍在上升，表明半纖維素水解達(dá)到平衡所需的理論時(shí)間更長。改性25 d的玉米秸木聚糖酶水解率最高，較對照組提高75.3%。

圖4 改性玉米秸木聚糖酶水解二級反應(yīng)模型擬合曲線及動力學(xué)參數(shù)Fig.4 Nidetzky and Ohminemodel and kinetics parameter of xylanase hydrolysis of corn stovermodified by P.ostreatus

Nidetzky木聚糖酶水解模型擬合結(jié)果顯示，改性時(shí)間延長，玉米秸的P值先增大后降低，改性30 d玉米秸P值最大，較對照組提高24%。改性玉米秸K值較對照組也有不同程度增大，改性玉米秸對木聚糖酶的水解反應(yīng)也更加穩(wěn)定。Ohmine模型擬合結(jié)果顯示，木聚糖酶在改性玉米秸上的初始反應(yīng)速率ν0低于對照組，尤其在改性時(shí)間大于30 d時(shí)，ν0明顯降低，這是由于改性玉米秸對木聚糖酶吸附率降低導(dǎo)致的。改性玉米秸k值隨改性時(shí)間延長先減小后增加，改性25 d和30 d時(shí)k值最小，木聚糖酶在這兩組改性秸稈上失活速率最低，水解持續(xù)時(shí)間最長。

綜合纖維素酶和木聚糖酶的兩組模型擬合結(jié)果表明，P.ostreatus改性會降低玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶的初始反應(yīng)速率，但玉米秸的反應(yīng)性提高，纖維素酶和木聚糖酶在玉米秸上的有效反應(yīng)時(shí)間延長，有利于甲烷轉(zhuǎn)化，25 d是最佳改性時(shí)間。

2.3 P.ostreatus改性對玉米秸厭氧消化產(chǎn)氣性能的影響

通過BMP試驗(yàn)分析P.ostreatus改性對玉米秸厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)率、甲烷轉(zhuǎn)化速率和生物降解消化性能的影響（表2）。改性25 d的玉米秸甲烷產(chǎn)率最大，為272mL/g，較對照組提高16.7%。8組改性時(shí)間中，改性35 d的玉米秸甲烷產(chǎn)率較對照組降低約1.3%，改性45 d的玉米秸甲烷產(chǎn)率降低12.4%。通過一級動力學(xué)擬合計(jì)算初始甲烷轉(zhuǎn)化速率和生物降解性的結(jié)果顯示，改性25 d的玉米秸初始甲烷轉(zhuǎn)化速率較對照組提高19.0%，生物降解性提高19.7%。改性45 d的玉米秸甲烷轉(zhuǎn)化速率降低4.8%，生物降解性降低6.6%。由此表明，改性25 d的玉米秸厭氧消化性能最佳，改性45 d的玉米秸厭氧消化性能最差。

表2 不同改性時(shí)間玉米秸甲烷產(chǎn)率、生物降解率及動力學(xué)參數(shù)Table 2 Biomethane yield，BD%and kinetic parameters of the corn stovermodified for different time

通過對改性玉米秸酶吸附、酶水解和厭氧消化性能進(jìn)行多角度分析結(jié)果表明，改性25 d后，玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶吸附率提升，進(jìn)而在酶水解過程中反應(yīng)性提高，失活率降低，酶水解效率提高。盡管酶初始反應(yīng)速率在改性25 d的玉米秸上降低，但水解過程更穩(wěn)定，促進(jìn)了玉米秸厭氧消化水解階段的正向進(jìn)行，提高了初始階段甲烷轉(zhuǎn)化速率。此外，改性25 d的玉米秸生物降解性上升，表明玉米秸可利用性提高，微生物對其中的木質(zhì)纖維素利用更充分，總甲烷產(chǎn)率提高。改性時(shí)間超過30 d時(shí)，玉米秸酶吸附和酶水解性能下降，使初始甲烷轉(zhuǎn)化速率降低。另外，此階段玉米秸的纖維素和半纖維素已被菌絲體大量消耗，生物降解性下降，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)率降低。

3 結(jié)論

P.ostreatus改性會改變玉米秸對纖維素酶和木聚糖酶的吸附和水解性，影響玉米秸厭氧消化甲烷產(chǎn)率。改性25 d的玉米秸纖維素酶和木聚糖酶吸附率分別提高42.5%和21.0%，纖維素酶和木聚糖酶水解率分別提高12.9%和75.3%，甲烷產(chǎn)率提高16.7%，甲烷轉(zhuǎn)化速率提高19.0%，生物降解性提高19.7%，最佳改性時(shí)間為25 d。