張煜坤，張曉霄，徐秀容*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2. 鹿兒島大學(xué)農(nóng)學(xué)部，日本 鹿兒島890-0065)

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選擇性培養(yǎng)基結(jié)合特異引物法分離鑒定家兔腸道脆弱擬桿菌*

張煜坤1，張曉霄2，徐秀容1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2. 鹿兒島大學(xué)農(nóng)學(xué)部，日本 鹿兒島890-0065)

脆弱擬桿菌作為嚴(yán)格厭氧菌，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻，分離培養(yǎng)有較大難度。試驗(yàn)通過(guò)改進(jìn)的選擇性培養(yǎng)結(jié)合特異引物方法分離兔源脆弱擬桿菌，并利用16 s rDNA測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定，為后續(xù)研究其與宿主關(guān)系奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)從健康青年家兔腸道中采集內(nèi)容物，先接種于含液態(tài)選擇性培養(yǎng)基的厭氧管中，進(jìn)行富集培養(yǎng)1～2 d，然后將培養(yǎng)的菌液稀釋后接種到選擇性培養(yǎng)基平板上，于厭氧罐中培養(yǎng)1～3 d，待長(zhǎng)出菌落后，觀察菌落形態(tài)，挑選符合脆弱擬桿菌菌落特點(diǎn)的單一菌落，培養(yǎng)后提取DNA，以脆弱擬桿菌特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。對(duì)擴(kuò)增出特異條帶的菌株，擴(kuò)增其16 s rDNA序列，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中脆弱擬桿菌序列進(jìn)行比對(duì)，以鑒定分離的菌株。結(jié)果表明，細(xì)菌為大小不一的桿菌，革蘭氏染色呈陰性。特異引物PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)顯示，挑取的27株單一菌落中，有7株可以擴(kuò)增出符合目的片段大小的產(chǎn)物。隨機(jī)選取兩株進(jìn)行16s rDNA測(cè)序，其序列與GenBank中的遞交的脆弱擬桿菌序列相似度大于99%，與其他細(xì)菌相似度均小于93.43%，可確定分離到的菌株為脆弱擬桿菌。

家兔；脆弱擬桿菌；分離；鑒定

腹瀉是威脅家兔健康的主要疾病，尤其是斷奶仔兔，養(yǎng)殖中60%～70%的健康問(wèn)題是由腹瀉引起，而且腹瀉引起的死亡可高達(dá)80%。目前，由于使用抗生素帶來(lái)的食品安全和抗藥性等問(wèn)題，使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注抗生素替代品的研究和應(yīng)用，這些替代品包括各種益生菌。與豬和雞等其他單胃動(dòng)物不同，家兔腸道中優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌，乳酸菌數(shù)量很少，而且沒(méi)有檢測(cè)到雙歧桿菌[1-2]。脆弱擬桿菌對(duì)人和大多數(shù)動(dòng)物是一種常見(jiàn)的厭氧病原體[3-5]，但作為家兔腸道尤其是盲腸中的主要優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)家兔盲腸發(fā)酵及腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育等可能起著重要的作用，分離兔源脆弱擬桿菌將為這些基礎(chǔ)研究創(chuàng)造條件，繼而為開(kāi)發(fā)家兔特異益生菌研究提供理論依據(jù)。脆弱擬桿菌為嚴(yán)格厭氧菌，通過(guò)焦性沒(méi)食子酸降低干燥器內(nèi)氧分壓改進(jìn)簡(jiǎn)易厭氧裝置，為無(wú)厭氧設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格厭氧菌的培養(yǎng)創(chuàng)造條件。目前特定菌種的分離多采用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基方法，然后通過(guò)生化形態(tài)鑒定其種屬，但傳統(tǒng)的鑒定方法不僅過(guò)程繁瑣，而且準(zhǔn)確性較差，近年來(lái)分子技術(shù)在細(xì)菌分類(lèi)上的應(yīng)用研究結(jié)果顯示，菌落形態(tài)和生化反應(yīng)相同的細(xì)菌可能屬于不同的菌種。利用選擇性培養(yǎng)基方法結(jié)合特異引物PCR方法，可以更快速更準(zhǔn)確地分離目的菌種。James等[6]篩選出脆弱擬桿菌的選擇性培養(yǎng)基，并用此培養(yǎng)基分離到脆弱擬桿菌。盡管在該培養(yǎng)基中添加了慶大霉素及促擬桿菌生長(zhǎng)的成分，提高了脆弱擬桿菌的檢出率，但分離出的菌株并非都是脆弱擬桿菌。Joseph等[7]根據(jù)脆弱擬桿菌的Leu基因設(shè)計(jì)了脆弱擬桿菌的特異性引物，利用該引物進(jìn)行熒光定量PCR，對(duì)腸道中脆弱擬桿菌進(jìn)行定量分析，定量結(jié)果均與實(shí)際結(jié)果一致，可以準(zhǔn)確的分析出樣品中脆弱擬桿菌的數(shù)量。目前該特異引物主要用于檢測(cè)糞便[8-11]及水體污染[12-14]樣品中脆弱擬桿菌的數(shù)量，還沒(méi)有將其用于脆弱擬桿菌分離鑒定的研究報(bào)道。由于脆弱擬桿菌嚴(yán)格厭氧，因此從動(dòng)物腸道中分離該菌以及通過(guò)生化培養(yǎng)鑒定都比較困難，尤其在無(wú)特定厭氧裝置的情況下。因此本研究設(shè)計(jì)出快捷的分離和鑒定兔源脆弱擬桿菌的方法，為脆弱擬桿菌在家兔腸道中的功能研究以及家兔特異益生菌開(kāi)發(fā)等提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 簡(jiǎn)易厭氧罐

本試驗(yàn)采用干燥器法。該方法造價(jià)低，操作較方便，密封性較好。利用焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉反應(yīng)消耗氧氣的特點(diǎn)，快速創(chuàng)造厭氧環(huán)境。厭氧環(huán)境的創(chuàng)造方法：計(jì)算干燥器體積，根據(jù)其體積(1 000 mL空間用焦性沒(méi)食子酸10 g，用10%氫氧化鈉溶液100 mL)稱(chēng)取焦性沒(méi)食子酸和配制氫氧化鈉溶液；然后將氫氧化鈉溶液倒人干燥器底部，盛有焦性沒(méi)食子酸的平皿輕輕浮于液面之上，放好隔板，將接種好的平板置于隔板上，并在隔板上點(diǎn)燃一支蠟燭，把干燥器蓋蓋上密封。輕輕搖動(dòng)干燥器，使焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉溶液混合并反應(yīng)，待蠟燭熄滅后置于37 ℃培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)用選擇性培養(yǎng)基制備與養(yǎng)分優(yōu)化

選擇性培養(yǎng)基需促進(jìn)脆弱擬桿菌生長(zhǎng)繁殖并抑制其他菌的生長(zhǎng)，本研究采用的FRAG選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)James等[6]試驗(yàn)配方進(jìn)行養(yǎng)分優(yōu)化。優(yōu)化方法是增加血紅素、維生素K和吐溫80以促進(jìn)脆弱擬桿菌生長(zhǎng)；脆弱擬桿菌抗慶大霉素、耐膽鹽，添加慶大霉素抑制非抗性菌，加入膽鹽抑制不耐膽鹽的微生物生長(zhǎng)。

1.3 選擇性培養(yǎng)基的厭氧優(yōu)化

按文獻(xiàn)[15]所示方法選擇培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧優(yōu)化處理：(1) 添加0.05%～0.1%的瓊脂(可減少分子氧的溶解，維持氧化還原電勢(shì)(Eh))；(2)添加0.5% L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5～1.0%葡萄糖和硫酸亞鐵溶液等還原劑以降低氧分壓；(3)培養(yǎng)基煮沸10～15 min以去除較多溶解氧。FRAG 選擇性培養(yǎng)基組成與配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量表1各種成分(慶大霉素待滅菌后冷卻至約55 ℃再加入)，補(bǔ)水至100 mL，用 l mol/L 的NaOH溶液調(diào)整pH至7.2～7.4。配制好培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入?yún)捬豕?，并根?jù)厭氧管大小通入足夠無(wú)氧氮?dú)猓缓笤?21 ℃下滅菌20 min。滅菌后在液體培養(yǎng)基上加1～2 cm厚的液體石蠟，密封備用。固體選擇培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上每100 mL中加1.5 g瓊脂，滅菌后在厭氧罐中冷卻至55 ℃加入慶大霉素，充分混勻后鋪平板。平板快速放入?yún)捬豕拗欣鋮s凝固備用。

表1 FRAG 培養(yǎng)基組成

注：①100 mL水中加下列成分配成礦物溶液: NaCl, 9.0 g; CaCl2.2H2O, 0.27 g;MgCl2.6H20, 0.2 g; MnCl2.4H20, 0.1 g; and CoCl2.6H20,0.1 g。此溶液4 ℃保存。②100 mL水中加0.04 g FeS04.7H20配成硫酸亞鐵溶液，4 ℃保存。

Notes：①The mineral solution contained the following in 100 ml of water: NaCl, 9.0 g; CaCl2.2H2O, 0.27 g;MgCl2.6H20, 0.2 g; MnCl2.4H20, 0.1 g; and CoCl2.6H20,0.1 g. This solution was stored at 4 ℃. ②The FeSO4solution contained 0.04 g of FeS04.7H20 in 100 ml of water and was stored at 4 ℃.

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

健康的青年家兔3只，供采集腸道內(nèi)容物。14日齡和30日齡(斷奶)健康仔兔各30 只，供毒性檢測(cè)試驗(yàn)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品采集及細(xì)菌培養(yǎng) 試驗(yàn)兔耳緣靜脈注射空氣處死，迅速打開(kāi)腹腔，分離結(jié)扎各個(gè)腸段，無(wú)菌操作，迅速采集盲腸內(nèi)容物。

無(wú)菌條件下將采集的內(nèi)容物迅速接種到厭氧管底部，37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，再將培養(yǎng)的菌液梯度稀釋?zhuān)臃N到含固態(tài)選擇培養(yǎng)基的平板上，在厭氧罐中37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。

1.5.2 菌落觀察與挑純 待長(zhǎng)出菌落后，觀察各平板上菌落生長(zhǎng)的形態(tài)，結(jié)合鏡檢，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離純化，以保證分離到單一菌株。

1.5.3 菌株的鑒定 對(duì)所分離的優(yōu)勢(shì)菌株，挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

特異引物法鑒定:將鏡檢符合脆弱擬桿菌的菌落在液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并提取DNA，以脆弱擬桿菌的特異引物L(fēng)eu-f/ Leu-r(CACTTGACTGTTGTAGATAAAGC/CATCTTCATTGCAGCAT TATCC)[7](目的片段為135 bp)進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

16S rDNA測(cè)序進(jìn)一步鑒定：隨機(jī)選取2株經(jīng)特異引物鑒定為陽(yáng)性的菌株提取細(xì)菌DNA，用16S rDNA通用引物Eubac 27F/Eubac 1492R(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/CGGTTACCT TGTTACGACTT)[19]進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用NCBI中的BLAST軟件與GenBank中的16srDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5.4 分離菌株對(duì)家兔毒性試驗(yàn) 將保存菌液活化培養(yǎng)后，充分混勻，取0.1 mL分別接種于含5.0 mL厭氧菌培養(yǎng)基的厭氧管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定菌液濃度，然后測(cè)定不同濃度菌液的OD值，利用菌液OD值與菌液濃度關(guān)系計(jì)算細(xì)菌含量。

選擇無(wú)疫情、飲水無(wú)病原菌污染的陰性兔場(chǎng)。隨機(jī)選取14日齡和30日齡(斷奶)體況相近健康仔兔各30 只，分別隨機(jī)分為A、B、C 3組。試驗(yàn)期為10 d，飼料中不添加抗生素及微生態(tài)制劑，每天11∶00～11∶30灌服菌液。A組灌服無(wú)菌培養(yǎng)基，B組灌服含1×108脆弱擬桿菌菌液，C組灌服2×108脆弱擬桿菌菌液。觀察各組幼兔糞便的變化及臨床反應(yīng)，記錄健康和死亡情況；稱(chēng)重，記錄體重變化。

2 結(jié) 果

2.1 選擇性培養(yǎng)基分離與形態(tài)鑒定

稀釋的內(nèi)容物接種在液體選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h可見(jiàn)厭氧管底部有少量渾濁，24 h渾濁度明顯增加。將該菌液稀釋接種于固體平板選擇性培養(yǎng)基12 h后可見(jiàn)到菌落長(zhǎng)出，24～36 h可挑單一菌落。

從圖1可看出，通過(guò)嚴(yán)格厭氧和優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌，革蘭氏染色呈陰性，菌體為長(zhǎng)短不一的多形性的桿菌，與脆弱擬桿菌相似。

2.2 特異引物擴(kuò)增分析

從圖2可以看出，以脆弱擬桿菌特異引物L(fēng)eu-f/ Leu-r為引物，以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR,27個(gè)菌落中有7個(gè)菌落獲得了大于100 bp小于250 bp的單一特異條帶，與目的片段(135 bp)長(zhǎng)度相符。

圖1 細(xì)菌革蘭氏染色 (×1000)

圖2 細(xì)菌DNA PCR產(chǎn)物電泳圖像

2.3 16S rDNA測(cè)序鑒定

經(jīng)過(guò)活力篩選后，選出兩株活力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)GenBank (登錄號(hào)KF706546，KF727478)。序列比對(duì)分析結(jié)果(表2)顯示，被鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank中的已有脆弱擬桿菌16S rDNA序列相似性大于99%，而與最相近的非脆弱擬桿菌16S rDNA序列相似性小于93.43%，可確定所分離的菌株為脆弱擬桿菌。

2.4 毒性檢測(cè)結(jié)果

分別從14日齡和30日齡開(kāi)始灌服的各組幼兔糞便無(wú)異常、采食正常、精神良好，各處理組均沒(méi)有病變和死亡仔兔。14～24日齡和30～40日齡各處理組間ADG差異均不顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 培養(yǎng)條件的控制

脆弱擬桿菌為中度厭氧菌，可在2%～8%氧分壓(平均3%)下生長(zhǎng)，在空氣中暴露60～90 min會(huì)死亡[15]，因此脆弱擬桿菌的培養(yǎng)以快速取樣和嚴(yán)格厭氧為核心。首先是創(chuàng)造厭氧培養(yǎng)環(huán)境。專(zhuān)業(yè)的厭氧培養(yǎng)箱或者工作站價(jià)格昂貴，操作與維護(hù)復(fù)雜，在分析了所培養(yǎng)厭氧菌的要求后設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)易培養(yǎng)罐適合小型實(shí)驗(yàn)室及野外采樣等少量培養(yǎng)。焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉溶液反應(yīng)后可吸收大量氧氣，加上蠟燭的燃燒耗氧，可使罐內(nèi)氧分壓達(dá)到脆弱擬桿菌的生長(zhǎng)要求。其次，需優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基養(yǎng)分。脆弱擬桿菌抗慶大霉素，添加慶大霉素可抑制非抗性菌生長(zhǎng)；脆弱擬桿菌耐膽鹽，培養(yǎng)基中加入20%膽汁或2 g/L 膽鹽可促進(jìn)本菌生長(zhǎng)，抑制不耐膽鹽的微生物；本試驗(yàn)還添加了0.02%吐溫80，增加了維生素K、氯化血紅素促進(jìn)其生長(zhǎng)。選擇性培養(yǎng)基的厭氧優(yōu)化也是促進(jìn)脆弱擬桿菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵。培養(yǎng)基煮沸可去除較多溶解氧，煮沸10～15 min可使Eh降低至10～100 mV；添加0.5%L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5～1.0%葡萄糖等還原劑及硫酸亞鐵溶液可降低Eh；添加0.05%～0.1%的瓊脂可減少分子氧的溶解，維持Eh；接種時(shí)接種在培養(yǎng)基底部有利于厭氧菌生長(zhǎng)；在液體培養(yǎng)基上加1～2 cm厚的液體石蠟隔絕氧的溶解；配制好培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入?yún)捬豕?，通入足夠無(wú)氧氮?dú)馀懦隹諝猓瑴p小氧分壓，條件允許情況下接種等步驟可在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。

表2 序列比對(duì)結(jié)果

表3 灌服脆弱擬桿菌對(duì)仔兔平均日增重的影響

由于液態(tài)培養(yǎng)基中的氧分壓要低于平板培養(yǎng)基表面，因此平板培養(yǎng)分離單菌落前，先用液態(tài)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可提高目的菌種的數(shù)量和比例。

3.2 鑒定方法

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是根據(jù)菌落形態(tài)、鏡檢和系列生化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，鑒定過(guò)程繁瑣，而且隨著分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌鑒定上的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，具有相同菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)果和生化反應(yīng)的細(xì)菌，可能不屬于同一種細(xì)菌，這說(shuō)明傳統(tǒng)鑒定方法存在局限性。由于細(xì)菌16s rDNA序列中的可變區(qū)域變異速度較快，不同菌種間往往存在差異，因此16srDNA序列測(cè)定方法成為鑒定細(xì)菌菌種的重要方法。本研究在鏡檢基礎(chǔ)上，先利用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的脆弱擬桿菌特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，然后對(duì)能夠擴(kuò)增出特異片段的菌株進(jìn)行16srDNA序列測(cè)定，可快速篩選出目的菌種。

在本研究中用脆弱擬桿菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的、具有脆弱擬桿菌菌落特點(diǎn)和鏡檢特點(diǎn)的27個(gè)菌株中只有7個(gè)菌株屬于脆弱擬桿菌。這說(shuō)明，相關(guān)研究推薦的脆弱擬桿菌選擇性培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌并非為單一的脆弱擬桿菌。

4 結(jié) 論

簡(jiǎn)易厭氧罐和厭氧管在嚴(yán)格的厭氧控制下可有效培養(yǎng)擬桿菌類(lèi)厭氧菌。優(yōu)化的選擇培養(yǎng)基可降低氧化還原電勢(shì)，促進(jìn)厭氧菌生長(zhǎng)，但該選擇性培養(yǎng)基并非為脆弱擬桿菌的專(zhuān)一性培養(yǎng)基，而脆弱擬桿菌特異引物PCR方法可以排除其中非脆弱擬桿菌；16s rDNA序列測(cè)序結(jié)果可鑒定本試驗(yàn)分離到的脆弱擬桿菌。本試驗(yàn)分離的脆弱擬桿菌菌株對(duì)家兔無(wú)致病致死等毒副作用，且對(duì)家兔日增重?zé)o影響。

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Isolation and Identification of Rabbit IntestinalBacteroidesFragilisby Selective Medium Combining with Specific Primers

ZHANG Yu-kun1,ZHANG Xiao-xiao2,XU Xiu-rong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.FacultyofAgriculture.KagoshimaUniversity,Kagoshima890-0065,Japan)

As a strictly anaerobic acterium,Bacteroidesfragiliswas difficult to isolate and cultivate because of the strict growing condition. This experiment was conducted to isolate and identify rabbit originalBacteroidesfragilisby combining specific culture medium and molecular techniques. The isolated rabbit originalBacteroidesfragiliswill provide the material to further research on the relationships between bacteria and its host. The intestinal content was collected from healthy young rabbit and inoculated to the liquid selective medium in anaerobic tube, and cultured for 1-2 days. Subsequently, the cultured bacteria were inoculated to the plate culture medium and cultured for 1-3 days in a simple anaerobic jar. After colonies were formed, 27 colonies were picked out from it, and then one part of each colony was used for preservation and the remaining was cultured to extract genomic DNA for PCR detection usingBacteroidesfragilisspecific primers. Finally, 16s rDNA sequences of the PCR-positive colonies were cloned using universal primers and sequenced. There were 7 strains withBacteroidesfragilisspecific bands when detecting the PCR products. Aligning the 16s rDNA sequence of these strains with the database in GenBank showed that it has more than 99 % similarity with the 16s rDNA sequence ofBacteroidesfragilisin GenBank and the highest similarity with other bacteria is 93.43%.

rabbits;Bacteroidesfragilis; isolation; identification

2014-10-09，

2014-11-28 [基金項(xiàng)目] 陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013K02-18)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(QN2011061)

張煜坤(1989-)，男，河北張家口人，碩士，主要從事動(dòng)物腸道微生物與免疫營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：zhangyukun672@163.com

*[通訊作者] 徐秀容(1969-)，女，湖北英山人，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：xuxiurong@yahoo.com

S811.6

A

1005-5228(2015)03-0058-05