夏利寧，高 娟，蘇戰(zhàn)強，程偉華，帕力達(dá)·亞森

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

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新疆克拉瑪依市某豬場不同生長期豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查*

夏利寧，高 娟，蘇戰(zhàn)強，程偉華，帕力達(dá)·亞森

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

為調(diào)查新疆克拉瑪依市某規(guī)?；i場不同生長期豬源大腸桿菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況，從該豬場的 550 份糞樣中分離出大腸桿菌 549 株，其中，哺乳豬源菌 200 株、妊娠豬源菌 100 株、保育豬源菌 100 株、育肥豬源菌 99 株和哺乳母豬源菌 50 株。試驗采用微量肉湯稀釋法測定不同生長期豬糞源大腸桿菌對 9 種臨床常用抗菌藥物的最小抑菌濃度。并通過卡方檢驗比較不同生長期豬糞源大腸桿菌耐藥率的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同生長期的豬糞源大腸桿菌均對氨芐西林和阿莫西林/克拉維酸兩種抗菌藥物高度耐藥。其中，保育豬糞源大腸桿菌對安普霉素、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸和頭孢噻呋的耐藥率顯著高于其他生長期豬糞源大腸桿菌(P<0.05)，哺乳豬和保育豬糞源大腸桿菌耐藥情況嚴(yán)重，對多種抗菌藥物高度耐藥，以 7 耐為主；育肥豬、哺乳母豬和妊娠豬糞源大腸桿菌以 3 耐為主。不同生長期的豬糞源大腸桿菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥程度不同。

不同生長期；大腸桿菌；耐藥；最小抑菌濃度

大腸桿菌作為人和動物的腸道共棲菌和條件性致病菌，可以通過耐藥質(zhì)粒和耐藥基因傳遞等多種方式將耐藥性傳播給人類，給食品安全和人類健康帶來潛在危害[1]。隨著抗菌藥物在畜牧業(yè)中廣泛使用，從人醫(yī)臨床、獸醫(yī)臨床以及環(huán)境分離的大腸桿菌存在耐藥，且有逐年增加趨勢[2]。此外，細(xì)菌多重耐藥性問題也日趨嚴(yán)重[3]。新疆作為全國畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，近幾年畜牧業(yè)發(fā)展迅速，本研究通過對克拉瑪依某規(guī)模化養(yǎng)豬場臨床分離的不同生長期豬源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查和分析，以掌握該地區(qū)不同生長期豬源大腸桿菌的耐藥情況，為該養(yǎng)殖場大腸桿菌病的防制和臨床用藥的風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)，并為該地區(qū)今后養(yǎng)殖業(yè)合理有效地使用抗菌藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

2013年3月在新疆克拉瑪依市某規(guī)模化豬場采集樣品。以健康豬為采集對象，通過肛拭子在其直腸采集新鮮糞樣共550份。分離試驗用大腸桿菌549株，采樣背景見表1。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌為ATCC25922(杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基

本研究所采用的麥康凱培養(yǎng)基和Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基均采購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗藥品

喹諾酮類：環(huán)丙沙星(含量為100%)、諾氟沙星(含量為99.6%)和恩諾沙星(含量為100%)；β-內(nèi)酰胺類：頭孢噻呋(含量為100%)、氨芐西林(含量為86.5%)和阿莫西林(含量為86.6%)/克拉維酸(含量為100%)；氨基糖苷類：慶大霉素(含量為99.5%)、安普霉素(含量為55.8%)和阿米卡星(含量為65.5%)；上述藥品均為標(biāo)準(zhǔn)品，采購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.4 試驗方法

1.4.1 藥物敏感性試驗 按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法。具體操作如下：按照倍比稀釋法，將抗菌藥物原液用MH肉湯稀釋成10個梯度，依次用8道排槍將其移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板前10列孔中，每孔100 μL。用MH肉湯將測試菌株稀釋成105CFU/mL，用移液槍由低濃度到高濃度在每排的前10孔依次加入稀釋菌液100 μL。每排的第11孔加100 μL對應(yīng)的稀釋菌液作陽性對照，每排的第12孔加100 μL滅菌肉湯作陰性對照。35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察各孔培養(yǎng)液中細(xì)菌的生長情況，以抑制細(xì)菌生長的藥物最低濃度作為測試藥物的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MICs)。對試驗用大腸桿菌針對上述藥物每株菌做2個平行，以ATCC25922菌株作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控。質(zhì)控菌對 9 種抗菌藥物的 MICs 均在質(zhì)控范圍內(nèi)，且陽性對照肉湯長菌，陰性對照肉湯清亮，則MICs 結(jié)果真實可信，結(jié)果判定參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會CLSI標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

表1 不同生長期的豬源大腸桿菌來源

1.4.2 統(tǒng)計分析 不同生長期豬源大腸桿菌耐藥率差異性分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

除育肥豬糞樣的大腸桿菌分離率為99.0%外，其余生長期豬糞樣的大腸桿菌分離率皆為100.0%。采樣數(shù)及分離率詳見表 1。

2.2 不同生長期豬糞源大腸桿菌耐藥結(jié)果及耐藥差異性分析

不同生長期的豬糞源大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥情況的耐藥結(jié)果見表2，由表2可以看出，分離的豬糞源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率較高，其中，保育豬糞源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高，占92.0%(92 株)，其次是妊娠豬糞源大腸桿菌和哺乳豬糞源大腸桿菌，分別占84.0%(84 株)和83.4%(167 株)，再次是育肥豬糞源大腸桿菌和哺乳母豬糞源大腸桿菌，耐藥率分別為82.8%(82 株)、82.0%(41 株)；除氨芐西林外，不同生長期的豬糞源大腸桿菌對阿莫西林/克拉維酸和慶大霉素的耐藥也較嚴(yán)重，耐藥率分別為保育豬糞源大腸桿菌91.0%(91 株)和79.0%(79 株)，育肥豬糞源大腸桿菌83.8%(83 株)和51.5%(51 株)，妊娠豬糞源大腸桿菌81.0%(81 株)和60.0%(60 株)，哺乳豬糞源大腸桿菌64.0%(128 株)、75.5%(151 株)，哺乳母豬糞源大腸桿菌52.0%(26 株)、62.0%(62株)。此外，哺乳豬和保育豬糞源大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物也表現(xiàn)出高度耐藥，特別是保育豬糞源大腸桿菌，對恩諾沙星和諾氟沙星耐藥率分別為79.0%(79 株)和63.0%(63 株)。

此外，從表2可知，保育豬糞源大腸桿菌對安普霉素(56.0%)、恩諾沙星(63.0%)、阿莫西林/克拉維酸(91.0%)和頭孢噻呋(41.0%)的耐藥率顯著高于其他生長期豬糞源大腸桿菌(P<0.05)；而哺乳豬糞源大腸桿菌對諾氟沙星(53.5%)、慶大霉素(75.5%)和恩諾沙星(67.0%)的耐藥率也顯著高于其他生長期(除保育豬外)豬糞源大腸桿菌(P<0.05)；與此同時，育肥豬糞源大腸桿菌對阿莫西林/克拉維酸(83.8%)的耐藥率顯著高于哺乳母豬和妊娠豬(P<0.05)；而哺乳母豬糞源大腸桿菌對環(huán)比沙星(40.0%)的耐藥率顯著高于其他生長期(除哺乳豬外)豬糞源大腸桿菌(P<0.05)。

2.3 不同生長期豬糞源大腸桿菌多重耐藥結(jié)果比較

由表3可知，不同生長期的豬糞源大腸桿菌的多藥耐藥結(jié)果存在差異，其中，妊娠豬糞源大腸桿菌以 3 耐(26.0%，26 株)為主，其次為 2 耐(13.0%，13株)和 5 耐(13.0%，13 株)，再次是 6 耐(12.0%，12 株)和 4 耐(10.0%，10 株)；哺乳豬糞源大腸桿菌以 7 耐(18.0%，36 株)為主，其次為 3 耐(15.5%，31 株)，再次為 6 耐(15.0%，30株)和 4 耐(11.5%，23 株)；保育豬糞源大腸桿菌以7耐(29.0%，29 株)和6耐(21.0%，21株)為主，其次為 5 耐(12.0%，12 株)、3 耐(11.0%，11 株)和 4 耐(8.0%，8株)；哺乳母豬糞源大腸桿菌以 3 耐(18.0%，9株)和5耐(18.0%，9株)為主，其次0耐、2耐和6耐皆為(14.0%，7株)；育肥豬糞源大腸桿菌以3耐(23.2%，23株)為主，其次是2耐(22.2%，22株)和4耐(20.2%，20株)。

表2 不同生長期耐藥差異性分析結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)記表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Data in the same row with lowercase superscripts were significantly different (P<0.05), those with the same or no superscripts indicates insignificant difference (P>0.05).

表3 不同生長期多藥耐藥差異性結(jié)果

3 討 論

分離的不同生長期豬源大腸桿菌對臨床常用的 3 大類 9 種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，且有各自的耐藥特點。以阿莫西林為例，保育豬源大腸桿菌耐藥率達(dá)91.0%，而哺乳母豬源大腸桿菌則不到60.0%。此外，哺乳豬糞源大腸桿菌株對諾氟沙星、恩諾沙星和安普霉素的耐藥率略高于其他生長期的豬源菌株，而保育豬糞源大腸桿菌對安普霉素、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸和頭孢噻呋的耐藥率顯著高于其他生長期豬糞源大腸桿菌(P<0.05),這可能與飼料中添加治療劑量的抗菌藥物用于疾病的防制有密切關(guān)系[6]，提示應(yīng)加強哺乳豬糞源大腸桿菌和保育豬糞源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測。不同生長期的豬糞源大腸桿菌對上述常用抗菌藥物的多藥耐藥結(jié)果也有所差異，妊娠豬糞源大腸桿菌和育肥豬糞源大腸桿菌都以 3 耐為主；哺乳母豬糞源大腸桿菌則以 3 耐和 5 耐為主；哺乳豬糞源大腸桿菌和保育豬糞源大腸桿菌多重耐藥情況較為嚴(yán)重，以 7 耐為主，猜測可能與用藥習(xí)慣有關(guān)，如長期使用某種藥物防治疾病，不注意間隔或輪換其它藥物，則易致使病原菌產(chǎn)生耐藥。

張秀杰等[7]對 2011 年包頭地區(qū)細(xì)菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)豬源大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到72.1%，對慶大霉素耐藥率為62.7%。Jiang等[8]2011 年對592 株豬源和禽源大腸桿菌耐藥性試驗顯示，耐藥性最高氨芐西林耐藥率可達(dá)99.5%，阿莫西林為65.1%。朱玲琦等[9]對2009-2012 年上海地區(qū)某醫(yī)院喹諾酮類藥物耐藥分析，結(jié)果表明大腸桿菌對左氧氟沙星的耐藥率大于67%。曹小利等[10]2012 年對多地區(qū)三甲醫(yī)院取樣研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥率為78.5%。阮祥春等[11]2013 年從安徽省部分地區(qū)多個豬場分離的大腸桿菌，經(jīng)過耐藥性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)豬源大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林耐藥菌高達(dá)70%以上，對恩諾沙星、氟苯尼考的耐藥菌株在30%以上，而對阿米卡星高度敏感。王汝都等[12]2013 年對周口地區(qū)豬致病性大腸桿菌耐藥性監(jiān)測，結(jié)果表明菌株中對阿莫西林的耐藥率達(dá)90.2%，對恩諾沙星的耐藥率為75.6%、對環(huán)丙沙星的耐藥率為59.5%，耐藥率高于本試驗結(jié)果。

不同地區(qū)大腸桿菌耐藥性存在差異是因各地區(qū)流行菌株不同導(dǎo)致其用藥不同。大腸桿菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的直接后果，是嚴(yán)重影響臨床療效，增加治療成本，同時縮短新藥應(yīng)用周期，增大新藥研究與開發(fā)成本[13]。同一耐藥類型菌株有著相似的耐藥譜型，可能是由于細(xì)菌處于相同的藥物選擇壓力下，從而導(dǎo)致相似耐藥譜型的出現(xiàn)，或在大腸桿菌中存在耐藥性的相互傳遞[6]。而抗菌藥物的不合理使用，加快了細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，使得耐藥性成為抗菌藥在獸醫(yī)臨床應(yīng)用中的一個嚴(yán)重問題。為了減少或延緩耐藥性的產(chǎn)生，在用藥的過程中應(yīng)嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥，交換使用不同種類或不同作用機制的藥物或聯(lián)合用藥[14]。

4 結(jié) 論

綜上所述，該豬場不同生長期豬糞源大腸桿菌對氨芐西林、慶大霉素和阿莫西林/克拉維酸抗菌藥物耐藥情況嚴(yán)重，在臨床治療細(xì)菌性疾病時，應(yīng)停用該類藥物，更換其他抗菌藥物作為治療藥物。不同生長期豬糞源大腸桿菌的多藥耐藥結(jié)果也不同，以 3 耐和 7 耐最常見，提示養(yǎng)殖廠應(yīng)樹立合理使用抗菌藥物的用藥理念。

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Survey on Tolerance ofEscherichiacoliIsolates from Swines at Different Growth Stages in Xinjiang

XIA Li-ning, GAO Juan, SU Zhan-qiang, CHENG Wei-hua, PALIDA Ya-sen

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

To investigate the tolerance ofE.coliisolates of swines at different growth stages in a pig farm in Karamay, Xinjiang, 549E.coliwere separated from 550 fecal samples, including 200E.colifrom the sucking piglets, 100 from nursery pigs, 100 from pregnant pigs, 99 from fattening pigs and 50 from lactating sows. Resistant rate ofE.colifrom pigs at different growth stages to nine kinds antibacterial drugs were determined by the broth micro-dilution method, chi square test to compare the difference.The results showed thatE.coliisolates from pigs at the different growth stages were highly resistant to ampicillin and amoxicillin / clavulanic acid. Among them, the resistance rate ofE.colito apramycin, enrofloxacin, amoxicillin / clavulanic acid and ceftiofur from nursery pigs was significantly higher than the resistance rate ofE.colifrom pigs at other growth periods (P<0.05),E.coliisolates from the lactating pigs and nursery pigs were highly resistant to 7 kinds of antimicrobial drugs.E.coliisolates from fattening pigs, lactating sows; pregnant pigs were resistant to 3 kinds of antimicrobial drugs. Resistance rate ofE.coliisolates to antimicrobial drugs were different at various growth periods.

different growth stages;E.coli; resistance; minimum inhibitory concentration

2014-11-19

2015-01-20 [基金項目] 國家自然科學(xué)基金項目(31260614)

夏利寧(1975-)，女，湖南人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)。E-mail：xln750530@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)09-0069-04