薛發(fā)珍

摘 要：這項生產工藝是本課題大量實驗的相關成果，借鑒法國公司依諾肝素鈉生產情況，采用一種原材料，經過科學、嚴謹?shù)纳a過程，所研制的依諾肝素鈉樣品符合歐洲藥典標準。根據實驗情況，文章總結了生產過程中需要重視的環(huán)節(jié)，使這種藥品國產化成為可能。

關鍵詞：依諾肝素鈉；生產；酯化率；成環(huán)率；純化

藥品依諾肝素鈉（enoxaparin sodium）是一種低分子肝素藥物，這種藥品是治療預防與腦血栓的最佳藥品之一，具有抗血栓作用強、出血危險性小等特征，經臨床試驗表明，依諾肝素鈉能達到抗凝血、抗血栓形成的顯著療效，故此，這種藥品具有重要的醫(yī)療價值，對生物制藥企業(yè)而言，大面積生產這種藥品，能帶來大量的經濟效益，同時也能滿足我國的醫(yī)療需求。

1 依諾肝素鈉的生產工藝

1.1 依諾肝素鈉現(xiàn)行的生產工藝

依諾肝素鈉主要特征為分子中有一個4-烯吡喃糖醛酸結構（圖1）。目前，醫(yī)療上使用的依諾肝素鈉都由法國Aventis公司研發(fā)，并由這家公司在1993年申請專利。由于這項專利未涉及生產過程中酯化率、成環(huán)率及產物純化等關鍵工藝，因此存在一定的缺陷，這就使得法國這家公司運用該專利生產的藥物樣品時，距離歐洲藥典4.0版規(guī)定的標準尚有一定的距離。

1.2 這項生產工藝的研究目的

這項研究主要是通過對相關反應條件的控制，研制出可以實現(xiàn)流水線生產依諾肝素鈉的生產工藝，生產出來的樣品，經過多次實驗，表明這些樣品的溶液顏色符合歐洲藥典4.0版要求，其余質量指標均符合歐洲藥典5.3版。

1.3 這項工藝所需的儀器與試劑

根據生產過程的相關要求，結合前期的研究情況，這項工藝所需的儀器、設備和試劑，有如下幾種：1100型高效液相色譜儀、TSK-GEL 凝膠色譜柱及1100型示差檢測儀均為Agilent產品；UV-2101PC型紫外檢測儀（日本島津）。肝素鈉（南京健友公司）；芐索氯銨[benz e thoniumchloride，化學名為芐基二甲基[2-[2-[4-（1，1，3，3-四甲基丁基）苯氧基]乙氧基]乙基]氯化銨，Sigma公司]；二氯甲烷、氯芐（上海三愛思試劑有限公司）；H103型非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂（南開大學化工廠，柱徑3.6cm，柱床體積550ml）；依諾肝素鈉標準品（歐洲藥典標準品）；其他試劑均為分析純。

2 依諾肝素鈉的生產過程

根據課題組的大量實驗，依諾肝素鈉的生產過程包括如下幾個步驟。

2.1 合成肝素芐索氯銨鹽

取肝素鈉10g，加水50ml溶解；取芐索氯銨25g溶于水100ml中，攪拌下將其緩慢加至肝素鈉溶液中，過濾。濾餅用水洗滌，烘干，得肝素芐索氯銨鹽31.2g。

2.2 合成肝素芐基酯

取肝素芐索氯銨鹽30g，加二氯甲烷150ml攪拌溶解后，緩慢滴加氯芐31.5ml，35℃反應25h。反應完畢加入溶有醋酸鈉18g的甲醇180ml，待沉淀析出后，過濾。濾餅用甲醇洗滌，干燥，得肝素芐基酯10.5g。

2.3 配制堿性溶液，解聚制成品

取肝素芐基酯30g，溶于水900ml中，加熱至62℃，加入氫氧化鈉4.5g，攪拌解聚1h。反應完畢，冷卻，用鹽酸調至pH 6.0，加氯化鈉90g使其終濃度為10%。邊攪拌邊加甲醇2.7L，析出沉淀過濾。濾餅用甲醇洗滌，減壓干燥，得黃褐色依諾肝素鈉粗品20g。

2.4 對粗品進行純化

取依諾肝素鈉的粗品23g，加水溶解得5%溶液，加入活性炭，攪拌，過濾，濾液減壓濃縮至濃度為25%（w/v）。將依諾肝素鈉濃縮液上非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂柱，用水洗脫，收集目標峰。收集液（約460ml）中加入3倍體積乙醇沉淀依諾肝素鈉，過濾，濾餅加適量水溶解后冷凍干燥，得依諾肝素鈉成品18.8g?？偸章蕿?0%。

2.5 檢測制成品

首先，精密稱取依諾肝素鈉標準品5mg，溶于0.2mol/L硫酸鈉溶液（pH5.0）0.5ml，配制成標準品溶液；其次，精密稱取依諾肝素鈉 10mg，溶于0.2mol/L硫酸鈉（pH5.0）溶液1ml，配制成供試品溶液。樣品檢測需要的色譜條件是：色譜柱TSK-GEL凝膠色譜柱（7.8mm×300mm，5μm），流動相 0.2mol/L硫酸鈉溶液（用稀硫酸調至pH5.0），流速0.5ml/min，檢測波長234nm進樣量25μl。所得數(shù)據用高效液相色譜儀自帶的Excel軟件計算。然后，開始檢測，取依諾肝素鈉和依諾肝素鈉標準品進行紅外和核磁共振研究。依諾肝素鈉樣品的紅外特征吸收峰和核磁共振圖譜均和標準品一致。依諾肝素鈉按歐洲藥典5.3版下方法檢測，結果見表1。另精密稱取依諾肝素鈉，按歐洲藥典5.3版下方法進行溶液比色，結果略深于6號色，但淺于歐洲藥典4.0版規(guī)定的5號色。

3 研究結論

根據課題組大量的前期實驗，根據這項生產工藝和生產方法，制造出來的依諾肝素鈉制品，完全達到歐洲藥典4.0版的標準要求，而且比法國公司的制成品要稍勝一籌，這就意味著這種藥品的國產化已經成為現(xiàn)實可能，必將降低消費者的相關醫(yī)療開支，給消費者帶來了福利，同時也會為我國相關生物制藥企業(yè)帶來潛在的商機。

根據前期的相關實驗，依諾肝素鈉制成樣品的質量情況和臨床療效，根據控制酯化率、控制成環(huán)率、樣品的純化有著直接的關系，生產過程中，如果著重注意上述三個環(huán)節(jié)，制成樣品一定能達到滿意的情況?？刂契セ实倪^程中，酯化率越高，解聚產物的平均分子量越低，只有當酯化率為12%～13%時，產物的分子量符合歐洲藥典5.3版的標準。因此，必須通過一些程序來降低制成品的酯化率。一些實驗數(shù)據表明，酯化率一般通過反應溫度和時間來控制。反應溫度越高，時間越長，酯化率越高。其次，根據實驗，制成品成環(huán)率的控制，主要在于聚集時間的控制，解聚時間為1小時左右，可使最終產物中1，6-脫水結構單元的含量符合歐洲藥典5.3版的標準。對于制成品中出現(xiàn)的一些有色雜質，利用活性炭和大孔吸附樹脂組合法對制成品進行脫色，可有效分離有色雜質，使得成品大部分指標符合歐洲藥典5.3版的標準。只要我國醫(yī)藥企業(yè)積極采用這項生產工藝，在生產過程中重視這三個環(huán)節(jié)的實時控制，一定能大批量生產出滿足臨床要求的依諾肝素鈉藥品。

參考文獻

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