分散液液微萃取—氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜快速分析食用油中的酚類抗氧化劑

邢寒竹等

摘 要 基于分散液液微萃取技術(shù)和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，建立了一種快速分析食用油中酚類抗氧化劑的新方法。對影響萃取效果的重要因素，如萃取劑種類及體積、分散劑種類及體積和萃取時間等進行了詳細優(yōu)化。優(yōu)化條件為：500 μL甲醇乙腈（1∶1， V/V）快速注射進3.0 mL 正己烷與1.0 g食用油的混合物中，并振蕩萃取10 s 。在優(yōu)化條件下，方法的線性范圍為10～2000 ng/g，檢出限為1.5～2.4 ng/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～8.3%。將本方法應(yīng)用于4種不同食用油樣品的分析，其中3種有酚類抗氧化劑檢出，樣品加標(biāo)回收率為81.9%～118%，結(jié)果滿意。

關(guān)鍵詞 分散液液微萃??； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 食用油； 抗氧化劑

1 引 言

酚類抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚（Butylated hydroxyanisole， BHA）、二叔丁基對甲酚（Butylated hydroxytoluene， BHT） 和叔丁基對苯二酚（TertButylhydroquinone， TBHQ），常被用來延緩食用油中油脂的氧化反應(yīng)。但研究表明，這些物質(zhì)被人體攝入會對人體健康具有潛在威脅[1～3]。因此，該類化合物在食品中的使用限值有嚴(yán)格的規(guī)定[4]，例如，在美國，BHA，BHT和TBHQ允許單獨或者混合使用，但添加量應(yīng)不超過200 mg/kg[5，6]；而在歐盟國家，BHA的最大使用量為200 mg/kg，BHT和TBHQ則被禁止使用。因此，建立一種快速靈敏的分析食用油中抗氧化劑的方法是十分必要的。

在分析食用油樣品之前，通常需要對食用油進行樣品預(yù)處理。已有的液液萃取[7，8]和固相萃取[9]等樣品預(yù)處理方法具有費時、費力、需要大量有毒有機溶劑等缺點[10]。為了克服這些缺點，簡化預(yù)處理步驟，分散液液微萃取技術(shù)（Dispersive liquidliquid micro extraction， DLLME）正逐漸被學(xué)者關(guān)注[11]。DLLME基于三相溶劑平衡體系，是在分散劑存在的條件下，將萃取劑以微小液滴的形式分散在水溶液樣品中，并形成穩(wěn)定的乳濁液[12]。在這種情況下，萃取劑與樣品間存在著極大的接觸面積，使目標(biāo)分析物可以快速的轉(zhuǎn)移至萃取體系中，經(jīng)過離心后，萃取劑液滴聚集，萃取和濃縮步驟得以同時完成。通常，DLLME主要應(yīng)用于分析環(huán)境水樣當(dāng)中的污染物，而針對食品樣品進行的應(yīng)用研究相對較少。目前，只有少數(shù)研究將DLLME應(yīng)用于食品中污染物的分析[13～15]，而將DLLME與GCMS/MS結(jié)合，分析食用油中酚類抗氧化劑的研究尚未見報道。

基于DLLME和GCMS/MS，本研究建立了一種快速靈敏的分析食用油中酚類抗氧化劑的新方法。對影響萃取效率的重要因素，如萃取劑種類及體積、分散劑種類及體積和萃取時間等進行了優(yōu)化。并將本方法應(yīng)用于多種食用油樣品的分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

氣相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A GC7000B MS，美國安捷倫公司）AB5MS色譜柱（30 m× 0.25 mm × 0.5 μm，美國熱電公司）。BHA（>99%）、BHT（>98.5%）和TBHQ（>96%）的標(biāo)準(zhǔn)品購自北京百靈威化學(xué)科技有限公司；乙腈、丙酮和正己烷（瑞典歐森巴克環(huán)境化學(xué)有限公司）；甲醇（美國天地公司）。所有實驗過程中所使用到的有機試劑均為色譜純級別。使用標(biāo)準(zhǔn)品配制3種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液，濃度均為1.0 g/L，保存在4 ℃避光環(huán)境中。

2.2 氣相色譜質(zhì)譜條件

色譜柱初溫60 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以40 ℃/min升至280℃，總運行時間為10.5 min。離子源溫度，230℃；進樣口溫度，280℃；載氣（高純氦）流速為1.2 mL/min，碰撞氣（高純氮）流速為1.5 mL/min；溶劑延遲時間，7 min。用全掃描（Fullscan）模式對BHA，BHT和TBHQ進行定性分析，定量分析則采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，優(yōu)化參數(shù)如表1所示。

2.3實驗步驟

稱取1.0 g食用油樣品，置于15 mL配有螺旋蓋的PE離心試管中。由于食用油粘度較大，在注射萃取劑之前，先加入3 mL正己烷分散劑稀釋，增加樣品流動性，使目標(biāo)物更快的由樣品轉(zhuǎn)移到萃取劑中。充分混勻后，將500 μL甲醇/乙腈（1∶1， V/V）混合溶液作為萃取劑快速注射進樣品中，振蕩萃取10 s，然后6000 r/min 離心5 min。離心后，萃取相沉積在試管底部，沉積相體積約為（150±10）μL，用250 μL微量注射器將萃取相轉(zhuǎn)移入400 μL玻璃內(nèi)插管中待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取劑種類和體積

在分散液液微萃取中，合適的萃取劑對于提高目標(biāo)化合物的萃取效率是至關(guān)重要的[16]。萃取劑的性質(zhì)決定了三相平衡體系的形成： （1）萃取溶劑必須不與樣品互溶； （2）目標(biāo)物在萃取劑中具有一定的溶解度； （3）萃取劑的密度應(yīng)大于油與分散劑的混合溶液?；谝陨蠗l件，本研究選擇了甲醇、乙腈及乙醇3種有機溶劑作為萃取劑考察其萃取效果。實驗結(jié)果表明，當(dāng)乙醇作為萃取劑時，離心后沒有沉積相產(chǎn)生，因此只選擇甲醇和乙腈作為萃取劑進行優(yōu)化。由圖1可見，使用甲醇乙腈（1∶1， V/V）混合溶液作為萃取劑的萃取效率比單獨使用任何一種溶劑更好，這可能是由于混合后溶劑極性的改變和溶劑誘導(dǎo)的選擇性的變化共同導(dǎo)致的。因此，最終以甲醇乙腈（1∶1， V/V）混合溶液作為萃取劑。

為評價萃取劑體積對萃取效率的影響，在其它實驗條件不變的情況下，改變甲醇乙腈（1∶1， V/V）混合溶液的體積進行實驗。結(jié)果表明，當(dāng)萃取劑體積小于400 μL時，得到的沉積相液滴過小，這將導(dǎo)致移取萃取相的操作困難。當(dāng)萃取劑體積在400～800 μL時，3種目標(biāo)化合物的峰面積隨萃取劑體積增加而逐漸增大； 在萃取劑體積為500 μL時， 峰面積達到最大； 萃取劑體積為500～800 μL時， 3種目標(biāo)化合物的峰面積隨萃取體積增大而降低（圖2）。最終，甲醇乙腈（1∶1， V/V）萃取劑體積選擇為500 μL。endprint

3.2 分散劑種類和體積

分散劑同樣是DLLME中影響三相平衡體系形成的一個重要因素。為了得到相對穩(wěn)定的乳濁液，使得目標(biāo)物可以被快速提取到萃取劑中，分散劑必須同時與食用油和萃取劑混溶。所以，溶混性是選擇分散劑的主要標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇了正己烷，丙酮和異丙醇3種同時與食用油和萃取劑互溶的有機溶劑進行實驗。結(jié)果表明，只有當(dāng)正己烷作為分散劑時，離心后才能得到便于移取的萃取沉積相。因此，選擇正己烷作為分散劑。

不同的萃取劑和分散劑比例可以影響萃取效率，為得到最優(yōu)的混合比例，考察了正己烷體積由2.0 mL增加至4.0 mL時（保持萃取劑體積為500 μL），BHA，BHT和TBHQ萃取效果的變化。結(jié)果證明，3種目標(biāo)物的峰面積并沒有隨分散劑體積的增大而產(chǎn)生明顯變化。當(dāng)正己烷體積小于2.0 mL時，分散效果會因樣品粘度過大而受到影響。綜合考慮，最佳的分散劑加入體積為3.0 mL。

3.3 萃取時間

在萃取時間10～300 s的范圍內(nèi)，考察了萃取效率隨萃取時間的變化情況。實驗結(jié)果表明，BHA，BHT和TBHQ的峰面積在萃取時間增加的過程中保持不變，萃取時間對萃取效率無明顯影響。這是因為當(dāng)食用油、萃取劑和分散劑三相混合形成穩(wěn)定的乳濁液時，萃取劑與食用油樣品之間會形成極大的接觸面積，從而在極短的時間內(nèi)完成萃取。所以，選擇10 s作為萃取時間。

3.4 方法評價

利用所建立的方法，對添加濃度為100 ng/g 的食用油平行測定5次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為4.0%～8.3%。方法線性范圍為10～2000 ng/kg，相關(guān)性系數(shù)（R2 ） 為0.9942～0.9990。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋， 以信噪比S/N=3計， 檢出限（LODs）為1.5～2.4 ng/g 。

將DLLMEGCMS/MS與現(xiàn)有的4種方法進行對比，結(jié)果見表2。首先，與液液萃取[7，8]相比，本方法在節(jié)省有機溶劑和萃取時間方面具有明顯的優(yōu)勢；其次，本方法不需要進行凈化、蒸發(fā)濃縮和加熱等繁瑣的預(yù)處理步驟，大大簡化了實驗操作；此外，其檢出限低于液液萃取[7，8]和直接進樣[18]方法，與超聲輔助液相微萃取方法[17]相近，完全可以滿足食用油中BHA，BHT和TBHQ的檢測要求。

3.5 實際樣品檢測

本實驗選擇了4種食用油樣品（調(diào)和油、葵花籽油、芝麻油和橄欖油）對本方法的適用性進行評價。所有樣品購自濟南市超市，樣品分析前均避光室溫保存。應(yīng)用DLLMEGCMS/MS方法分析4種不同種類的食用油樣品（結(jié)果見表3），3種合成酚類抗氧化劑在3個樣品中分別有檢出。向4種食用油中添加3個濃度水平的BHA，BHT和TBHQ（20，100和500 ng/g），回收率分別為83.7%～115%，85.0%～118%和81.9%～102 %，具體結(jié)果見表3。結(jié)果表明，不同樣品的基質(zhì)效應(yīng)對該方法沒有顯著的影響。圖3為檢測芝麻油中BHA，BHT和TBHQ的總離子流圖。

4 結(jié) 論

基于DLLME和GCMS/MS技術(shù)，建立了一種簡單、快速、靈敏的用于分析食用油中痕量酚類抗氧化劑BHA，BHT和TBHQ的方法。本方法所用的樣品和有機溶劑消耗少，萃取時間短，環(huán)境污染小且成本低廉。與現(xiàn)有的BHA，BHT和TBHQ檢測方法相比，本方法線性范圍寬（10～2000 ng/g），檢出限低（1.5～2.4 ng/g）且重復(fù)性好（RSDs<8.5%），能夠很好地滿足不同食用油中酚類抗氧化劑的分析要求。

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Abstract A novel， simple and highly sensitive method was developed for the rapid analysis of phenolic antioxidants at trace level in edible oils. It was based on dispersive liquidliquid microextraction （DLLME） and gas chromatographymass/mass spectrometry （GCMS/MS）. Related important factors that may influence enrichment efficiency， such as type and volume of extraction solvent， type and volume of dispersive solvent， and extraction time were investigated and optimized in detail. The optimum conditions were as follows： a quick injection of 500 μL mixed solution （methanol：acetonitrile=1∶1， V/V） into 1.0 g oil sample with 3 mL nhexane for 10 s of extraction time. Under the optimal conditions， the linearity （10-2000 ng/g）， limits of detection （1.5-2.4 ng/g） and relative standard deviations （4.0%-8.3%） was obtained. The proposed method was applied for the analysis of 4 edible oil samples. Some of phenolic antioxidants were detected in three of them， and the recoveries of spiked samples were in the range of 81.9%-118%.

Keywords Dispersive liquidliquid microextraction； Gas chromatographytandem mass spectrometry； Edible oils； Antioxidants

（Received 19 September 2014； accepted 30 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21477068， 21007035）endprint