李春梅 楊瑞 周新惠 卻翎 毛曉健 趙榮華

三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根，是一種常用的的名貴中藥，具有散瘀止血，消腫定痛之功效［1］11。臨床上有生三七、熟三七兩種飲片。經(jīng)清蒸后的三七稱為熟三七，熟三七長于滋補，用于身體虛弱、氣血不足的患者。傳統(tǒng)中醫(yī)及民間對三七均有“生攆熟補”之說，即認為生三七化瘀止血作用較強，而熟三七以滋補力勝［2］。

中藥有別于天然藥物的一個主要方面就是“加工炮制”后應(yīng)用，而中醫(yī)的一大特點就是辨證施治和復(fù)方配伍。在遣藥組方時又非常講究“藥之生熟”，生熟效異，用法不同，各有其功。本實驗擬探討生、熟三七在復(fù)方配伍中功效有無差異，為編制《三七生、熟異用飲片臨床鑒別手冊》提供實驗依據(jù)。本實驗選擇三七常用的復(fù)方制劑:復(fù)方丹參片。組方中丹參、三七、冰片三味藥合用，具有活血化瘀，理氣止痛之功效，是臨床治療胸痹之胸悶、心前區(qū)刺痛，冠心病心絞痛見上述證候者的常用中成藥［1］904-905。其中的三七分別以生三七和蒸制三七配入復(fù)方丹參中，以觀察生、熟三七在復(fù)方丹參中配伍后對小鼠失血性貧血、環(huán)磷酰胺所致的貧血、小鼠耳廓微循環(huán)、全血切變率及主要免疫器官的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物

昆明種清潔級健康小白鼠，18 ～22 g，雌雄各半。購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號:SCXK(20120008)。

1.2 儀器與試劑

北京眾馳ZL1000P 血液流變儀(北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司)，URIT-2900 全自動血細胞分析儀(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司)，精密電子天平(型號JA2003 SHP07003，上海恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))，一次性使用含有乙二胺四乙酸二抗凝劑(EDTAK2)采血管(規(guī)格:3 mL，湖南省瀏陽市醫(yī)用儀具廠，生產(chǎn)批號:120812)。

三七(云南文山苗鄉(xiāng)三七實業(yè)有限公司，批號20120920)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院炮制中心趙榮華教授鑒定，為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥主根，商品規(guī)格為60 頭。丹參(云南省藥材公司延壽堂經(jīng)營部，產(chǎn)地:河南，為唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖)、冰片(云南省藥材公司延壽堂經(jīng)營部)，由省藥材公司吳應(yīng)華副主任藥師鑒定。

注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號:12041025);復(fù)方丹參片(云南白藥集團股份有限公司，生產(chǎn)批號:ZD12002);復(fù)方阿膠漿口服液(山東東阿阿膠股份有限公司，生產(chǎn)批號:1204512)。

1.3 實驗方法

1.3.1 生三七復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參制備方法 (1)生、蒸制熟三七粉制備:將生三七洗凈，潤透，切成0.3 cm 左右厚薄片，晾干，混合均勻，分成二等份。取其中一份用粉碎機粉碎，過80 目篩;另一份置于蒸籠中隔水蒸6 小時至熟透，60℃烘干并粉碎，過80 目篩。(2)丹參稠膏制備［1］527:按藥典方法提取，50℃減壓濃縮至稠膏(約100 mL);均分成兩分。(3)生三七制復(fù)方丹參(簡稱生丹參，以下均同):取一份丹參稠膏加入31.33 g 生三七粉，混合均勻后置于70℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重(前后兩次稱重之差小于0.3 mg)得63.28 g，再加入冰片1.77 g 后粉碎并過100 目篩后密封置于干燥器中，每次使用前配成需要濃度的混懸液(其中高劑量濃度為1.11×10-1g/mL;低劑量濃度為0.37 ×10-1g/mL)。熟三七制復(fù)方丹參(簡稱熟丹參，以下均同)的制法同上，把生三七粉替換成熟三七粉即可。

1.3.2 失血性貧血小鼠的實驗方法 取小鼠72 只隨機分為6 組:生三七制復(fù)方丹參高、低劑量組，蒸制熟三七復(fù)方丹參高、低劑量組，陽性對照組、空白對照組。斷尾取血法取血約0.2 mL/10 g，EDTAK2抗凝，全自動血細胞分析儀檢測各組小鼠血常規(guī)的正常值(0 小時)。失血后24 小時再取血測定血常規(guī)作為失血后數(shù)值(24 小時)。確認貧血后開始給藥:每天灌胃1 次，灌胃給藥均為0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥12 天。于末次給藥后30 分鐘，對所有小鼠摘眼球法取血，測各組小鼠血常規(guī)作為給藥后數(shù)值(12 天)。將取血后小鼠脫臼處死，快速摘取脾臟、腎上腺、胸腺。用精密電子天平分別稱各臟器的鮮重，計算臟器指數(shù)［臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)］［3］1202。

1.3.3 環(huán)磷酰胺造成的小鼠貧血的實驗方法 取小鼠84 只隨機分為7 組:生三七制復(fù)方丹參高、低劑量組，蒸制熟三七復(fù)方丹參高、低劑量組，陽性對照組、模型組、空白對照組，每組12 只。在給藥的前3 天除空白對照組以0.1 mL/10 g 腹腔注射生理鹽水外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺(250 mg/kg)。每天灌胃1 次，連續(xù)給藥7 天。第7 天末次給藥后30 分鐘，用摘眼球法對所有小鼠取血，EDTAK2抗凝，再次檢測小鼠血常規(guī)，將小鼠脫臼處死，快速摘取脾臟，腎上腺，胸腺。用精密電子天平分別稱各臟器的鮮重，并計算臟器指數(shù)［3］1055。

1.3.4 小鼠微循環(huán)障礙的實驗方法 取小鼠72 只隨機分成6 組:生三七制復(fù)方丹參高、低劑量組，蒸制熟三七復(fù)方丹參高、低劑量組，復(fù)方阿膠漿組、空白對照組，每組12 只。每天灌胃1 次，連續(xù)給藥7天。于末次給藥后 30 分鐘開始造模，按0.1 mL/10 g尾靜脈注射6%高分子右旋糖苷(40 萬單位)后放入冰水中2 分鐘，取出，肌內(nèi)注射水合氯醛溶液0.03 mL/10 g 麻醉，以醫(yī)用膠布粘貼去耳廓毛，將小鼠腹向下固定在觀察臺上，調(diào)節(jié)特制有機玻璃耳托高度，使耳廓平展在耳托上，滴加少許香柏油于耳托和耳廓表面，置顯微鏡載物臺上，在透射光下(冷光源)，用10 ×40 倍鏡下觀察小鼠耳廓微循環(huán)并用顯微測微尺分別測錄在給藥后10 分鐘、20 分鐘、30 分鐘時耳廓微循環(huán)細動脈(A)、細靜脈(V)血管口徑、毛細血管開放數(shù)量(毛細血管網(wǎng)交點記數(shù)法)，將小鼠從冰水中取出后，用摘眼球法取血，用全自動血液流變儀測小鼠全血液切變率［3］534-537。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 對失血性貧血小鼠的影響

造模前后數(shù)據(jù)兩兩比較用配對t 檢驗法，多組之間的兩兩比較采用LSD 法。采用失血后各組小鼠紅細胞總數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞總數(shù)均顯著降低。連續(xù)給藥12 天后，紅細胞總數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞總數(shù)均有不同程度的升高;與空白組比較，生、蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑量組均能極其顯著升高小鼠的紅細胞總數(shù)(P ＜0.001);生、蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組升高小鼠的紅細胞總數(shù)，但不顯著;生、蒸制熟三七復(fù)方丹參高低劑量組均能極其顯著升高小鼠的血紅蛋白含量(P ＜0.001);生三七制復(fù)方丹參高低劑量組及蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組均能極顯著升高小鼠的白細胞總數(shù)(P ＜0.01)，具體見表1。

表1 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對失血性貧血小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響(±s)

表1 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對失血性貧血小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響(±s)

注:與空白組比較aP ＜0.05;與復(fù)方阿膠漿組比較bP ＜0.05。

組別 紅細胞(×1012/L) 血紅蛋白(g ∕L) 白細胞(×109 ∕L)空白組0 小時 6.74 ±0.88 129.75 ±14.89 6.73 ±1.30 24 小時 4.67 ±0.32 94.58 ±5.90 5.43 ±1.47 12 天 5.79 ±0.59b 91.26 ±4.25b 4.69 ±1.15b復(fù)方阿膠漿組0 小時 6.15 ±0.62 125.57 ±13.75 6.79 ±2.04 24 小時 4.27 ±0.63 89.17 ±10.60 6.85 ±1.57 12 天 6.16 ±0.35a 128.57 ±7.57a 6.60 ±1.09a生三七制復(fù)方丹參高劑量組0 小時 6.45 ±0.77 130.38 ±19.40 5.85 ±1.44 24 小時 4.64 ±0.94 90 ±18.17 5.36 ±1.26 12 天 5.92 ±0.66 119.09 ±10.61a 6.25 ±0.95a生三七制復(fù)方丹參低劑量組0 小時 6.43 ±0.89 130.21 ±5.91 6.38 ±1.16 24 小時 5.00 ±0.54 99 ±14.82 5.3 ±1.22 12 天 6.56 ±0.52 ab 137.85 ±5.67a 6.01 ±1.21a蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組0 小時 6.59 ±0.99 127.43 ±18.09 6.71 ±2.72 24 小時 4.72 ±0.30 92.67 ±9.9 5.7 ±0.77 12 天 6.14 ±0.73 123.18 ±10.90a 6.31 ±1.48a蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑量組0 小時 6.3 ±1.06 121.43 ±23.2 6.31 ±1.48 24 小時 4.71 ±0.66 93.44 ±18.66 5.12 ±1.02 12 天 6.47 ±0.47a 128.08 ±12.16a 5.72 ±1.02 a

各給藥組對胸腺指數(shù)及腎上腺指數(shù)影響不顯著，生三七制復(fù)方丹參高劑量組能顯著增加失血性小鼠脾臟指數(shù)(P ＜0.05)，復(fù)方阿膠漿組能顯著增加失血性小鼠胸腺指數(shù)(P ＜0.05)，具體見表2。

表2 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對失血性小鼠臟器重量的影響(±s)

表2 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對失血性小鼠臟器重量的影響(±s)

注:與空白組比較aP ＜0.05;與復(fù)方阿膠漿組比較bP ＜0.05。

組別 胸腺(×10 -3mg/g) 脾臟(×10 -3mg/g) 腎上腺(×10 -3mg/g)空白組 2.62 ±0.67b 6.40 ±0.78 0.25 ±0.07復(fù)方阿膠漿組 3.22 ±0.66a 7.22 ±1.74 0.26 ±0.07生三七制復(fù)方丹參高劑量組 7.74 ±1.90 7.74 ±1.90a 0.24 ±0.06生三七制復(fù)方丹參低劑量組 6.32 ±1.87 6.32 ±1.87 0.25 ±0.09蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑組 6.38 ±1.91 6.38 ±1.91 0.21 ±0.06蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑組 4.95 ±1.23 4.95 ±1.23ab 0.23 ±0.06

2.2 對環(huán)磷酰胺致血虛小鼠的影響

多組之間的兩兩比較采用LSD 法。造模后各組小鼠白細胞數(shù)均顯著降低，連續(xù)給藥12 天后，均有不同程度的升高，與模型組比較，各組均能顯著升高小鼠白細胞數(shù)(P ＜0.05)。生三七制復(fù)方丹參高、低劑量組及蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組能其顯著升高小鼠白細胞數(shù)(P ＜0.05)，蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組優(yōu)于生三七制復(fù)方丹參。各給藥組均能升高環(huán)磷酰胺造成的血紅蛋白含量的減少，但只有蒸制熟三七復(fù)方丹參高、低劑量組有顯著性差異。與空白組比較，各給藥組均能極顯著升高失血性貧血小鼠的紅細胞數(shù)(P ＜0.05)，其中以生三七制復(fù)方丹參高劑量組極其顯著(P ＜0.001)，具體見表3。

表3 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對環(huán)磷酰胺所致血虛小鼠血常規(guī)的影響(±s)

表3 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對環(huán)磷酰胺所致血虛小鼠血常規(guī)的影響(±s)

注:與正常對照組比較aP ＜0.05;與復(fù)方阿膠漿組比較bP ＜0.05;與模型組比較cP ＜0.05。

組別 紅細胞(×1012/L) 血紅蛋白(g ∕L) 白細胞(×109 ∕L)正常對照組 7.34 ±0.55c 148.33 ±14.60b 7.43 ±1.29 b模型對照組 5.74 ±0.67ab 119.78 ±26.58a 4.26 ±0.95ab復(fù)方阿膠漿 6.82 ±0.80c 130.63 ±25.08a 6.16 ±1.10c生三七制復(fù)方丹參高劑量組 7.01 ±1.01c 131.57 ±23.12a 5.41 ±1.62ac生三七制復(fù)方丹參低劑量組 6.53 ±1.99ac 131.17 ±4.54a 5.55 ±1.74ac蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組 6.42 ±0.64ac 142.5 ±20.08c 5.89 ±1.21ac蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑量組 6.57 ±0.63ac 134.5 ±17.13c 5.17 ±1.05 a

經(jīng)注射環(huán)磷酰胺后模型組胸腺指數(shù)、腎上腺指數(shù)均顯著低于正常對照組(P ＜0.01)。連續(xù)給藥7天后，蒸制熟三七復(fù)方丹參組有升高胸腺指數(shù)的趨勢，但作用不顯著;各給藥組都有升高脾臟指數(shù)的趨勢，但只有生三七制復(fù)方丹參低劑量組及蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組有顯著差異;各給藥組對小鼠腎上腺指數(shù)無影響，詳見表4。

表4 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對環(huán)磷酰胺所致血虛小鼠臟器指數(shù)的影響(±s)

表4 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對環(huán)磷酰胺所致血虛小鼠臟器指數(shù)的影響(±s)

注:與空白組比較aP ＜0.05;與模型組比較cP ＜0.05;與復(fù)方阿膠漿組比較bP ＜0.05。

組別 胸腺(×10 -3mg/g) 脾臟(×10 -3mg/g) 腎上腺(×10 -3mg/g)正常對照組 3.33 ±0.72b 5.20 ±0.84 0.27 ±0.07模型對照組 1.63 ±0.44a 5.45 ±0.78 0.23 ±0.05復(fù)方阿膠漿 1.36 ±0.28a 5.94 ±0.68 0.25 ±0.04生三七制復(fù)方丹參高劑量組 1.17 ±0.29ac 5.79 ±0.51 0.28 ±0.04生三七制復(fù)方丹參低劑量組 0.98 ±0.22ac 6.39 ±0.85ac 0.30 ±0.07蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組 1.58 ±0.32a 6.85 ±1.47abc 0.26 ±0.04蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑量組 1.78 ±0.38a 6.17 ±0.90a 0.25 ±0.08

2.3 對小鼠微循環(huán)障礙的影響

各給藥組對小鼠耳廓微循環(huán)動脈口徑影響不明顯，生三七制復(fù)方丹參對靜脈口徑10 分鐘、20 分鐘及30 分鐘時影響都顯著，但蒸制熟三七復(fù)方丹參只在10 分鐘時影響顯著，20 分鐘及30 分鐘時影響不顯著;說明生三七制復(fù)方丹參效果優(yōu)于蒸制熟三七復(fù)方丹參，且作用時間更持久，詳見表5。

表5 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對小鼠微循環(huán)障礙的影響(±s)

表5 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對小鼠微循環(huán)障礙的影響(±s)

注:與空白組比較aP ＜0.05;與復(fù)方阿膠漿組比較bP ＜0.05。

組別 動脈口徑(mm) 靜脈口徑(mm) 毛細血管開放數(shù)(條)空白組10 分鐘 0.19 ±0.03 0.34 ±0.06 4.17 ±0.84 20 分鐘 0.19 ±0.04 0.36 ±0.06 4.25 ±0.62 30 分鐘 0.19 ±0.04 0.36 ±0.06b 4.00 ±0.60復(fù)方丹參片組10 分鐘 0.19 ±0.05 0.33 ±0.08 4.40 ±0.74 20 分鐘 0.19 ±0.06 0.36 ±0.07 4.40 ±0.52a 30 分鐘 0.21 ±0.08 0.43 ±0.09a 5.00 ±0.63生三七制復(fù)方丹參高劑量組10 分鐘 0.21 ±0.05b 0.42 ±0.09ab 3.18 ±0.60ab 20 分鐘 0.20 ±0.00 0.44 ±0.04ab 3.73 ±1.00 30 分鐘 0.20 ±0.04 0.42 ±0.07a 3.36 ±0.67ab生三七制復(fù)方丹參低劑量組10 分鐘 0.16 ±0.03 0.46 ±0.09ab 3.67 ±0.78 20 分鐘 0.18 ±0.03 0.42 ±0.05a 4.00 ±0.60b 30 分鐘 0.20 ±0.00 0.44 ±0.06a 4.17 ±0.72蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組10 分鐘 0.21 ±0.05b 0.46 ±0.10ab 3.64 ±0.81 20 分鐘 0.17 ±0.04 0.39 ±0.09 3.73 ±0.79 30 分鐘 0.19 ±0.03 0.38 ±0.05 3.73 ±0.65蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑量組10 分鐘 0.16 ±0.03 0.43 ±0.09ab 3.56 ±0.73 20 分鐘 0.17 ±0.03 0.39 ±0.09 4.11 ±0.82b 30 分鐘0.17 ±0.02 0.38 ±0.08 3.67 ±0.50

與空白組比較，復(fù)方丹參片組可顯著降低全血黏度(低切P ＜0.01，中切P ＜0.05)，生三七制復(fù)方丹參高劑量組有降低的趨勢，但作用不顯著，詳見表6。

表6 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對小鼠不同切變率的全血黏度的影響(±s)

表6 生三七制復(fù)方丹參、蒸制熟三七復(fù)方丹參對小鼠不同切變率的全血黏度的影響(±s)

注:與空白組比較aP ＜0.05;與復(fù)方阿膠漿組比較bP ＜0.05。

200正常對照組 82.90 ±25.82b 29.56 ±14.26b 14.65 ±7.64b 9.17 ±4.88組別 切變率1 切變率5 切變率30 切變率b復(fù)方丹參片組 42.09 ±17.89a 15.26 ±6.34a 7.14 ±2.99a 4.63 ±2.00a生三七制復(fù)方丹參高劑量組 87.59 ±8.01 29.92 ±2.34b 13.03 ±1.17 7.98 ±0.94生三七制復(fù)方丹參低劑量組 84.70 ±15.21 30.35 ±5.87b 13.63 ±2.96 8.48 ±2.16蒸制熟三七復(fù)方丹參高劑量組 113.26 ±35.81a 39.17 ±12.58b 17.31 ±5.72b 10.72 ±3.65蒸制熟三七復(fù)方丹參低劑量組 103.49 ±5.64 36.13 ±2.46b 16.15 ±1.37b 10.09 ±1.00

3 討論

實驗結(jié)果表明，生、蒸制熟三七復(fù)方丹參均能顯著增加血細胞總數(shù)、血紅蛋白含量及白細胞總數(shù)，提示生、蒸制熟三七復(fù)方丹參均具有補血的作用。有文獻闡述了三七的補血作用［4］及炮制后的熟三七也具有補血作用，生三七與熟三七兩者補益功效無顯著性差異［5］，根據(jù)實驗結(jié)果表明生三七及蒸制三七在配伍到復(fù)方丹參中仍具有補血功效，且與兩者補血作用相當(dāng)，與生三七與蒸制熟三七補血功效理論一致，即三七沒有隨著復(fù)方丹參的配伍遣方而改變原有補益的功效。

生三七制復(fù)方丹參擴張動脈口徑作用較熟三七制復(fù)方丹參持久，且有改善血液黏稠度的趨勢，相反熟三七制復(fù)方丹參卻有升高全血黏度的趨勢，提示生三七及蒸制熟三七在配伍到復(fù)方丹參中改善微循環(huán)方面，存在一定的差異。因此通過對“血瘀”模型動物全血黏度的影響的研究，為臨床遣方使用生、蒸制熟三七發(fā)揮不同功效提供科學(xué)依據(jù)。生三七制復(fù)方丹參雖然有一定得改善微循環(huán)作用，但是效果低于市售的復(fù)方丹參片，這可能與在實驗過程中對于混合藥物的研磨不夠精細，藥物顆粒較粗有關(guān)，致使生物利用度降低，也可能與給藥時間周期較短有關(guān)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:11，527，904-905.

［2］徐冬英.三七藥用考［J］.中藥材，2002，25(7):510-513.

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