龔一萍，沈煒毅

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053）

縫隙連接（GJ）是心肌細(xì)胞電、化學(xué)信號(hào)傳遞的通道，協(xié)調(diào)心肌細(xì)胞同步化收縮?？p隙連接蛋白43（Cx43）形成的連接子是其主要組成部分，其磷酸化狀態(tài)程度不同，影響其自身的合成裝配以及GJ的功能。Cx43的磷酸化狀態(tài)受到多重激酶途徑調(diào)節(jié)，發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)也不盡相同，且Cx43的磷酸化位點(diǎn)改變與缺血性心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。John T.Fong等［1］研究認(rèn)為蛋白激酶ERK可以介導(dǎo)Cx43在Ser262、Ser279/282位點(diǎn)磷酸化，降低細(xì)胞間正常的通訊功能。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)脈湯能抑制EKR的表達(dá)量，逆轉(zhuǎn)EKR介導(dǎo)Cx43 Ser262位點(diǎn)的磷酸化通道，維持縫隙連接蛋白結(jié)構(gòu)，維系縫隙通訊功能，降低缺血性心律失常的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)欲以Cx43 Ser279/282磷酸化水平為靶點(diǎn)，探討復(fù)脈湯對缺血性心律失常保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠58只，動(dòng)物許可證號(hào)：2008001638685，體重 200～300 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔飼養(yǎng)室保持恒溫（20℃），相對濕度40%～60%。

1.1.2 藥物與試劑 復(fù)脈湯（由炙黃芪20 g，生曬參10 g，丹參 15 g，川芎 10 g，紅花 10 g，紅景天 10 g，延胡索10 g，酸棗仁15 g，制遠(yuǎn)志10 g等組成，單味中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部提供）；炙甘草湯（炙甘草 12 g，生姜 9 g，桂枝 9 g，黨參 6 g，生地黃 25 g，阿膠 6 g，麥冬 10 g，麻子仁 10 g，大棗 10枚。單味中藥由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部提供）；酒石酸美托洛爾（50 mg/片，批號(hào)：H32025390）由阿斯利康制藥有限公司提供。主要試劑：3%戊巴比妥鈉（美國 Sigma，Sigma-P3761），兔抗 Cx43 Ser279/282 多克隆抗體（SANTA CRUZ公司自制），內(nèi)參GAPDH抗體（up-date公司），ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒（Ther-mo公司），PVDF膜（Life Science公司），辣根堿過氧化物酶標(biāo)記的山羊二抗（Novogene公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ALc-V9小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司），小動(dòng)物多道生理記錄儀（法國ekma），高速組織勻漿器（美國Pro公司），化學(xué)發(fā)光、熒光和可見光凝膠成像系統(tǒng)（美國OmegaLum G公司），可調(diào)微量加樣器（德國Eppendorf公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 將58只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，假手術(shù)組、美托洛爾組、炙甘草湯組，復(fù)脈湯高、中、低劑量組，每組8只，模型組10只。美托洛爾組給藥濃度10 mg/mL，炙甘草湯組0.940 mg/mL，復(fù)脈湯高劑量組3.750 g/mL，復(fù)脈湯中劑量組1.875 g/mL，復(fù)脈湯低劑量組0.9375 g/mL，每只按照10 mL/kg灌胃給藥，1次/d，假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃2 w。

1.2.2 模型制備 大鼠急性心肌缺血模型制作參考文獻(xiàn)［2］的方法，通過左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎略作改進(jìn)。連續(xù)灌胃2 w后，將手術(shù)大鼠分籠飼養(yǎng)，禁食12 h，自由飲水。次日各組大鼠術(shù)前1 h給藥并稱重后，以3%戊巴比妥鈉以1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后仰臥固定于鼠臺(tái)上，頸部與胸部皮膚去毛，常規(guī)消毒。逐層分離頸部皮膚、肌肉，暴露氣管，開胸前氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)行人工呼吸（頻率為 60 次/min，潮氣量 2.5 mL/100 g，呼吸比為 2∶1）。四肢皮下連接心電圖電極，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在胸骨左側(cè)第3、4肋骨處切開皮膚，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，用開瞼器撐開胸腔，剝開心包膜，用鑷子輕輕掀開左心耳，以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間的左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，結(jié)扎的位置定在左心耳下緣1～2 mm，用6-0號(hào)無創(chuàng)帶針縫合線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針深度控制在1～2 mm，寬約2 mm，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。結(jié)扎即刻左室前壁及心尖部心肌顏色蒼白，結(jié)扎成功的標(biāo)志為心電圖II導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯抬高，ST段抬高大于0.15 mV。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其余步驟相同。術(shù)后暖光燈調(diào)節(jié)大鼠體溫在37℃左右，及時(shí)清除大鼠氣管分泌物，出現(xiàn)室顫用棉簽輕輕按壓心臟除顫。

1.2.3 觀察指標(biāo) 記錄各實(shí)驗(yàn)組每只大鼠缺血后心律失常出現(xiàn)時(shí)間以及缺血期間心律失常的發(fā)生次數(shù)。檢測各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞Cx43 ser279/282磷酸化水平。

取缺血心肌組織100 mg，研磨至粉末，加入1000μL裂解液勻漿，在4℃下以12000 rpm離心20 min，取上清液，采用紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度。根據(jù)濃度，制備50 μg上樣蛋白。

配制10%分離膠10 mL，灌膠至玻璃板2/3處，再將5%濃縮膠注入，直至離玻璃頂部1 cm處，將梳子插入濃縮膠液體中，室溫聚合30 min。拔出梳子，以電泳緩沖溶液沖洗點(diǎn)樣孔。用電泳緩沖溶液充滿電泳槽的上下槽，用微量注射器將50 μg制備好的蛋白樣品加入到加樣孔中，空置加樣孔用等體積的加樣緩沖液填充。濃縮膠加電壓8 V/cm，進(jìn)入分離膠后改電壓為15 V/cm，進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部后電泳結(jié)束。

轉(zhuǎn)膜前準(zhǔn)備適當(dāng)大小的PVDF膜和濾紙。PVDF膜在甲醇浸泡1～2 min活化，然后與預(yù)冷在轉(zhuǎn)膜緩沖液的濾紙、海綿，依次配成海綿墊→3層濾紙→凝膠→PVDF膜→3層濾紙→海綿墊，將濾紙、膠、PVDF膜對齊，將每層間的氣泡排空，加入電轉(zhuǎn)緩沖液，連接電源，80 V冰浴中轉(zhuǎn)印2 h。

封閉：將轉(zhuǎn)膜放入以TBST溶解的5%BSA液中封閉2 h。

一抗孵育：將PVDF膜放入TBST稀釋的兔抗Cx43 ser279/282磷酸化多克隆抗體和內(nèi)參（GAPDH）多克隆抗體（1∶200），4 ℃過夜。

二抗孵育：加入辣根堿過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。

顯色：取出膜，在濾紙上瀝干液體，將膜浸入ECL發(fā)光液（A 液∶B 液=1∶1），反應(yīng) 2～3 min；將 PVDF 膜置于塑料薄膜上，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，圖片經(jīng)Image Pro-Plus軟件處理圖像中蛋白條帶，分析各組Cx43和GAPDH蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎成功率100%，模型組因結(jié)扎過深，出現(xiàn)惡性心律失常導(dǎo)致死亡2只，余均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.1 對缺血性心律失常的影響

各組心律失常出現(xiàn)時(shí)間及發(fā)生次數(shù)比較，結(jié)果見表1。

表1 各組心律失常出現(xiàn)時(shí)間以及發(fā)生次數(shù)的比較（±s）

表1 各組心律失常出現(xiàn)時(shí)間以及發(fā)生次數(shù)的比較（±s）

注：與模型組比較，1）P<0.01；與炙甘草湯組比較，2）P<0.01，3）P<0.05

組別 n 心律失常出現(xiàn)時(shí)間（s） 心律失常（次）假手術(shù)組 8 - -模型組 8 134.88±22.21 849±136美托洛爾組 8 189.00±18.421）2） 338±1821）2）炙甘草湯組 8 149.63±32.01 674±89復(fù)脈湯高劑量組 8 193.63±28.341）2） 329±1931）2）復(fù)脈湯中劑量組 8 182.75±26.441）3） 440±2111）3）復(fù)脈湯低劑量組 8 174.50±23.121） 493±2071）3）

由表1可見，與模型組比較，復(fù)脈湯高、中、低劑量組及美托洛爾組心律失常出現(xiàn)時(shí)間顯著延遲，缺血性心律失常發(fā)生次數(shù)顯著減少（P<0.01）；與炙甘草湯組比較，復(fù)脈湯中、高劑量組及美托洛爾組心律失常出現(xiàn)時(shí)間明顯延遲，復(fù)脈湯各劑量組及美托洛爾組缺血性心律失常發(fā)生次數(shù)顯著減少（P<0.05，P<0.01）。

2.2 各組心肌組織Cx43 ser279/282磷酸化水平比較

結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 各組心肌組織Cx43 ser279/282磷酸化相對表達(dá)量

圖2 復(fù)脈湯對心肌組織Cx43 pser279/282的影響

假手術(shù)組Cx43 ser279/282磷酸化相對表達(dá)量（Cx43 pser279/282/GAPDH）為（1.0763±0.0895），模型組為（1.6399±0.0942）；復(fù)脈湯高、中、低劑量組，美托洛爾組Cx43 pser279/282/GAPDH分別為（1.3353±0.0924）、（1.3850±0.0551）、（1.4351±0.0858）、（1.3481±0.0386）。與模型組比較，假手術(shù)組、復(fù)脈湯各劑量組及美托洛爾組均顯著降低（P<0.01）；炙甘草湯組Cx43 ser279/282/GAPDH 為（1.5383±0.0636），與炙甘草湯組比較，復(fù)脈湯高、中劑量組及美托洛爾組顯著降低（P<0.05，P<0.01）；復(fù)脈湯各劑量組與美托洛爾組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），復(fù)脈湯各劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討 論

最新研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血時(shí)細(xì)胞內(nèi)的氧自由基增加、鈣超載、酸中毒等可導(dǎo)致縫隙連接的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引起電脫耦聯(lián)誘發(fā)缺血性心律失常［3］。研究發(fā)現(xiàn)，PKC、PKA、ERK、CK1等蛋白激酶可以使Cx43蛋白羧基末端絲氨酸（serine ser）殘基的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通過磷酸化Cx43絲氨酸殘基368位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)降低Cx43通道通透性和調(diào)節(jié)縫隙連接通訊的作用［4］。酪蛋白激酶 1（casein kinase 1，CK1）可直接磷酸化Cx43的325、328或330位點(diǎn)的絲氨酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的Cx43裝配形成GJ通道，使GJ傳導(dǎo)性增加［5］。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）是通過磷酸化Cx43 ser262或ser279/282位點(diǎn)，使縫隙連接從細(xì)胞與細(xì)胞間內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞間的通訊功能降低。

前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)脈湯通過抑制EKR的表達(dá)量，逆轉(zhuǎn)EKR介導(dǎo)Cx43 Ser262位點(diǎn)的磷酸化，維持縫隙連接蛋白結(jié)構(gòu)，維系縫隙通訊功能，對缺血性心律失常起到保護(hù)作用［6］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，復(fù)脈湯各劑量組與模型組比較Cx43 ser279/282磷酸化水平顯著降低（P<0.01），提示復(fù)脈湯對缺血性心律失常的保護(hù)作用可能與降低Cx43 Ser279/282磷酸化水平有關(guān)。復(fù)脈湯高、中劑量組Cx43 Ser279/282磷酸化水平明顯低于炙甘草湯組（P<0.01），說明復(fù)脈湯抑制Cx43 Ser279/282磷酸化水平呈劑量依賴性。復(fù)脈湯與美托洛爾對抑制Cx43 Ser279/282磷酸化水平作用效果相當(dāng)。

越來越多的證據(jù)表明，非抗心律失常的藥物能夠減少患者死于心律失常的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，β受體阻滯劑、他汀類藥物、ACEI和ARB類等藥物，能改善心肌缺血缺氧、酸中毒的微環(huán)境以及修復(fù)缺血引起心律失常病理結(jié)構(gòu)。復(fù)脈湯治療氣虛血瘀型心律失常臨床療效顯著。益氣活血的中藥可以修復(fù)心肌缺血產(chǎn)生心律失常病理組織結(jié)構(gòu)，從本治療心律失常［7］。炙甘草湯以益氣養(yǎng)陰為法則治療心律失常，缺少活血化瘀藥，對心肌缺血保護(hù)作用不明顯，故效果不及復(fù)脈湯。復(fù)脈湯中丹參、紅花、川芎等活血化瘀中藥可改善缺血區(qū)的血液微循環(huán)，保證心肌細(xì)胞正常功能，保障心肌細(xì)胞及細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的完整性，抑制心律失常的發(fā)作。又經(jīng)藥理研究證實(shí)，復(fù)脈湯中黃芪、生曬參、丹參、甘松等中藥的有效成分對心律失常發(fā)生有直接對抗作用。陸文娟等［8］研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷、人參總皂苷對蟾酥致小鼠心律失常有一定的保護(hù)作用。楊萍等［9］研究認(rèn)為丹參酮IIA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常具有良好的保護(hù)作用。路永平等［10］研究發(fā)現(xiàn)甘松具有抗心肌缺血，提高心肌耐缺氧能力及抗心律失常作用，對氯化鈉、氯仿-腎上腺素引起的心律失常有對抗作用，其提取物纈草酮對異位性室性節(jié)律有較強(qiáng)的抑制作用。

綜上所述，復(fù)脈湯對缺血性心律失常的保護(hù)作用與抑制Cx43 Ser279/282磷酸化信號(hào)通道，維持細(xì)胞間通訊功能有關(guān)。效果優(yōu)于炙甘草湯，與美托洛爾作用相當(dāng)，其機(jī)制可能與改善心肌缺血，保證心肌細(xì)胞完整性，維持心肌細(xì)胞間正常結(jié)構(gòu)有關(guān)。

［1］John T.Fong，Wutigri Nimlamool，Matthias M.Falk.EGF induces efficient Cx43 gap junction endocytosis in mouse embryonic stem cell colonies via phosphorylation of Ser262，Ser279/282，and Ser368［J］.FEBS，2014，588（5）：836-844.

［2］周文武，劉玲，陳軍，等.冠狀結(jié)扎法制做大鼠心肌缺血模型［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，2004，12（4）：226-230.

［3］王廣強(qiáng).步長穩(wěn)心顆粒通過調(diào)節(jié)Cx43穩(wěn)定性抗缺血性心律失常作用研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2013.

［4］EK-Vitorin J F，King T J，Heyman N S，et al.Selectivity of connexin 43 channels is regulated through protein kinase C-dependent phosphorlation［J］.Circ Res，2006，98（12）：1498-1505.

［5］Cooper C D，Lampe P D.Casein kinase 1 regulates connexin-43 gap junction assembly［J］.J Biol Chem，2002，277（47）：44962-44968.

［6］龔一萍，沈煒毅.基于Cx43磷酸化信號(hào)通路介導(dǎo)復(fù)脈湯對缺血性心律失常的保護(hù)作用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17（8）：5-7.

［7］李惠霞，王淑麗.益氣活血湯治療缺血性心律失常 72例［J］.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2008，22（5）：16.

［8］陸文娟，周婧，馬宏躍，等.黃芪甲苷、人參總皂苷和西洋參總皂苷對蟾酥致小鼠心律失常的影響［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（1）：61-64.

［9］楊萍，賈鈺華，李杰，等.丹參酮IIA對缺血再灌注損傷大鼠心律失常及IMA、H-FABP水平的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20（6）：517-520.

［10］路永平，王麗.從細(xì)胞電生理角度闡述甘松抗心律失常機(jī)理［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44（9）：678-679.