高 闖，張 全

（1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2. 中國(guó)石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

生物刺激與生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤

高 闖1，2，張 全2

（1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2. 中國(guó)石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

從柴油污染土壤中篩選分離出一株高效降解柴油的菌株CY-1，考察了自然衰減修復(fù)、生物刺激修復(fù)、生物強(qiáng)化修復(fù)以及生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)等4種修復(fù)方法對(duì)土壤中柴油的降解能力及降解過(guò)程中幾種土壤微生物酶活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該菌為假單胞菌屬；采用生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)初始柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%的柴油污染土壤，經(jīng)過(guò)31 d的降解，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.09%，柴油去除率達(dá)59.6%；經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)，土壤脫氫酶活性和熒光素二乙酸酯水解酶活性最高；通過(guò)生物刺激處理可使土壤脲酶活性和磷酸酶活性達(dá)到最高。

柴油污染土壤；生物修復(fù)；生物刺激；生物強(qiáng)化；酶活性

柴油進(jìn)入土壤后會(huì)影響土壤的生態(tài)循環(huán)能力［1］，暴露于環(huán)境中還會(huì)對(duì)人類(lèi)身體健康造成危害［2-3］。土壤生物修復(fù)技術(shù)是美國(guó)環(huán)境總署推薦的優(yōu)選土壤修復(fù)技術(shù)之一。目前，單純針對(duì)柴油開(kāi)展的生物刺激研究較少，大部分生物刺激的研究是關(guān)于石油降解方面的。Diaz-Martinez等［4］研究了生物刺激、生物強(qiáng)化以及植物聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤的過(guò)程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合適的添加劑能刺激接種菌的生長(zhǎng)，提高植物修復(fù)效率。Dias等［5］對(duì)南極洲的柴油污染土壤進(jìn)行了生物刺激原位修復(fù)的研究，45 d內(nèi)柴油降解率可達(dá)49%。Zhang等［6］從原油污染土壤中獲得了兩株能以柴油為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，降解15 d后，柴油降解率達(dá)70%。

本工作從柴油污染土壤中篩選、分離出一株高效降解柴油的菌株CY-1，考察了自然衰減修復(fù)、生物刺激修復(fù)、生物強(qiáng)化修復(fù)以及生物刺激與生物強(qiáng)化相結(jié)合的聯(lián)合修復(fù)等方法對(duì)柴油污染土壤的修復(fù)過(guò)程，對(duì)比了不同修復(fù)方法的柴油降解效果及土壤酶活，為修復(fù)過(guò)程的強(qiáng)化提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

丙酮、正己烷：分析純。

土樣：取自某市加油站附近的柴油污染土壤，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%；0#柴油：購(gòu)自中國(guó)石化加油站。

土壤營(yíng)養(yǎng)液：以KH2PO4和NH4NO3配制，加入后使土壤中的n（C）∶n（N）∶n（P）= 100∶1.25∶1。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

在上述培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂，即得相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

6010型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：惠普公司；GC-2010型氣相色譜儀：日本島津公司；CEM型微波萃取儀：美國(guó)培安公司。

1.2 柴油降解菌的篩選及鑒定

向10 g柴油污染土壤中加入100 mL滅菌后的生理鹽水，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h。加入經(jīng)孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾滅菌的柴油3 mL，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天加入滅菌柴油并持續(xù)培養(yǎng)3 d。將獲得的泥漿用滅菌生理鹽水逐級(jí)稀釋?zhuān)?.1 mL涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24 h，利用平板劃線(xiàn)法分離單菌落。

將各純化后的菌株分別接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)濾滅菌柴油的30 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，觀(guān)察其生長(zhǎng)情況。將生長(zhǎng)情況良好的菌株制備成菌懸液。用生理鹽水重懸浮并調(diào)節(jié)菌懸液濃度，使其在600 nm處的吸光度（OD600）為1.0。

在80 cm2×20 cm的桶內(nèi)裝入300 g柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%的污染土壤，控制土床高度約為5 cm。在桶內(nèi)添加10 mL菌懸液。將加入不同菌液的土壤試樣置于培養(yǎng)箱中，在溫度為25 ℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，10 d后取樣測(cè)定土壤中柴油含量，觀(guān)察比較降解效果。

菌株的鑒定工作委托中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成。

1.3 柴油污染土壤的修復(fù)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置自然衰減組、生物刺激組、生物強(qiáng)化組以及生物刺激-生物強(qiáng)化組等4組土壤試樣，各組的修復(fù)方法見(jiàn)表1。將柴油污染土壤分別按照表1中的4種方法處理后，置于25 ℃培養(yǎng)箱中，過(guò)夜后作為實(shí)驗(yàn)起始點(diǎn)，每天翻動(dòng)土壤并加入去離子水使土壤中的水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%±2%。

表1 土壤試樣的修復(fù)方法

1.4 分析方法

1.4.1 菌濃度的測(cè)定

以細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600值表征培養(yǎng)液中的菌濃度。

1.4.2 柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

以體積比為1∶1的丙酮和正己烷混合溶液作為萃取劑，采用微波萃取儀萃取土壤中的柴油。用氣相色譜儀測(cè)定萃取劑中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算得到土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)。氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃，色譜柱規(guī)格30 m×0.53 mm，柱溫40 ℃保持2 min，以15 ℃/ min的速率梯度升溫至290 ℃，保持3 min，進(jìn)樣量1 μL。

1.4.3 土壤酶活的測(cè)定

1.4.3.1 土壤脫氫酶活性的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定土壤中微生物的脫氫酶活性以確定微生物對(duì)有機(jī)污染物的氧化分解能力，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)［7］，以反應(yīng)液于486 nm處的吸光度（OD486）表征土壤的脫氫酶活性。

1.4.3.2 土壤熒光素二乙酸酯水解酶活性的測(cè)定

通過(guò)熒光素二乙酸酯（FDA）水解酶活性表征微生物活性的方法已逐步應(yīng)用到植物殘?bào)w、土壤、河底沉積物、活性污泥以及深海底泥的微生物活性分析中。具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)［8］，以反應(yīng)液于490 nm處的吸光度（OD490）表征土壤FDA水解酶的活性。

1.4.3.3 土壤脲酶活性的測(cè)定

在土壤的氮素循環(huán)中，脲酶是唯一的底物為尿素的酶類(lèi)，屬于氮素轉(zhuǎn)化以及循環(huán)中最重要的酶類(lèi)。通過(guò)測(cè)定脲酶活性可以定量評(píng)價(jià)土壤肥力的高低。測(cè)定方法：將2 g風(fēng)干土壤置于50 mL離心管中，加入600 μL甲苯，完全潤(rùn)濕土壤，靜置15 min。然后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的尿素溶液和4 mL pH=6.7的檸檬酸緩沖液，搖勻。在培養(yǎng)箱中于溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速145 r/min條件下振蕩反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后加入38 ℃熱水至20 mL，振蕩后經(jīng)孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。取1 mL濾液至25 mL定容管中，加入少許去離子水，并加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液，充分搖均。靜置20 min后，溶液變?yōu)榈宸铀{(lán)色，加水至刻度，混勻后測(cè)定溶液在578 nm處的吸光度（OD578），以此表征土壤脲酶的活性。

1.4.3.4 土壤磷酸酶活性的測(cè)定

磷酸酶屬于生物界廣泛存在的酶類(lèi)，能參與土壤中無(wú)機(jī)磷的釋放循環(huán)，并能催化磷酸單酯鍵的水解，在磷素循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。具體測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)［9］，以反應(yīng)液于510 nm處的吸光度（OD510）表征土壤磷酸酶的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 柴油降解菌的篩選及鑒定

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)，在LB固體培養(yǎng)基平板上得到6株能以柴油為碳源生長(zhǎng)的菌株，分別命名為CY-1～6。6株菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，菌株CY-3生長(zhǎng)情況最好，而菌株CY-2和CY-6生長(zhǎng)情況較差。因此，選擇菌株CY-1，CY-3，CY-4，CY-5進(jìn)行柴油降解實(shí)驗(yàn)。

圖1 6株菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

加菌10 d后土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)10 d的生物強(qiáng)化處理，添加CY-1菌液的土壤的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為1.56%。結(jié)合圖1和圖2的結(jié)果，選擇菌株CY-1作為高效柴油降解菌。

圖2 加菌10 d后土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)

經(jīng)16S rDNA基因序列鑒定CY-1為假單胞菌屬。革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌。

2.2 修復(fù)方法對(duì)柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

修復(fù)方法對(duì)柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)：隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)，自然衰減組中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，基本維持在2.50%左右，這是由于柴油易被土壤表面吸附，不利于自然揮發(fā)［10］；降解時(shí)間為31 d時(shí)，經(jīng)生物強(qiáng)化處理后的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.29%，經(jīng)生物刺激處理后的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.45%，經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)的土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.09%，柴油去除率為59.6%。由此可見(jiàn)，采用生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤的效果最好。

圖3 修復(fù)方法對(duì)柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3 修復(fù)方法對(duì)脫氫酶活性的影響

修復(fù)方法對(duì)脫氫酶活性的影響見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)：自然衰減組的脫氫酶活性始終保持較低水平；經(jīng)生物刺激處理后，脫氫酶活性有所增加，但活性低于生物強(qiáng)化處理的酶；經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理后的脫氫酶活性最高。前期對(duì)土壤中柴油的降解主要是由加入的降解菌來(lái)完成，后期則是土著菌群發(fā)揮了降解作用。添加營(yíng)養(yǎng)源有利于降解菌株以及土壤本身土著微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)了脫氫酶活性的增加。

圖4 修復(fù)方法對(duì)脫氫酶活性的影響

2.4 修復(fù)方法對(duì)FDA水解酶活性的影響

修復(fù)方法對(duì)FDA水解酶活性的影響見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)：各種修復(fù)方法處理的前5 d，F(xiàn)DA水解酶活性均較低，這說(shuō)明柴油污染物對(duì)微生物活性的影響較大；自然衰減組的FDA水解酶一直維持在較低的水平；經(jīng)生物強(qiáng)化處理后的FDA水解酶活性前期較低，后期隨著污染物的降解，土壤微生態(tài)得以恢復(fù)；隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)生物刺激處理和生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理后的FDA水解酶活性的增長(zhǎng)趨勢(shì)相近，由于降解菌的加入，在降解后期生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理后的FDA水解酶活性高于生物刺激處理。

圖5 修復(fù)方法對(duì)FDA水解酶活性的影響

2.5 修復(fù)方法對(duì)脲酶活性和磷酸酶活性的影響

修復(fù)方法對(duì)脲酶活性和磷酸酶活性的影響分別見(jiàn)圖6和圖7。由圖6和圖7可見(jiàn)：在4種處理方式中，通過(guò)生物刺激處理后的脲酶活性和磷酸酶活性最高，說(shuō)明添加適當(dāng)比例的養(yǎng)分對(duì)于土壤養(yǎng)分循環(huán)的恢復(fù)作用明顯；而只通過(guò)生物強(qiáng)化處理，在整個(gè)降解過(guò)程中，脲酶活性和磷酸酶活性均未得到明顯恢復(fù)。

圖6 修復(fù)方法對(duì)脲酶活性的影響

圖7 修復(fù)方法對(duì)磷酸酶活性的影響

3 結(jié)論

a）從柴油污染土壤中分離出一株高效降解柴油的菌株CY-1，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。

b）采用生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理方法修復(fù)柴油污染土壤的效果最好。在初始土壤中柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%的條件下，經(jīng)過(guò)31 d的降解，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.09%，柴油去除率59.6%。

c）經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)，土壤脫氫酶活性和FDA水解酶活性最高；通過(guò)生物刺激處理可使土壤脲酶活性和磷酸酶活性達(dá)到最高。

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（編輯 王 馨）

Remediation of Diesel Contaminated Soil by Bio-Stimulation and Bio-Augmentation

Gao Chuang1，2，Zhang Quan2
（1. College of Petrochemical Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China；2. SINOPEC Fushun Petrochemical Research Institute，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China）

A diesel-degrading strain （CY-1） was isolated from the diesel-contaminated soil. 4 different processes were used for bioremediation of diesel-contaminated soil，such as: nature attenuation，bio-stimulation，bio-augmentation，and bio-stimulation-bio-augmentation. The degradation of diesel in soil and the change of enzyme activities of soil microorganism in the 4 degradation processes were studied. The experimental results show that：The strain CY-1 is identified as genusPseudomonas；When the diesel-contaminated soil with 2.70% of initial diesel mass fraction has treated by the bio-stimulation-bio-augmentation combination process for 31 d，the diesel mass fraction is deceased to 1.09%，the diesel removal rate reaches 59.6%；The enzyme activities of soil dehydrogenase and f uorescein diacetate（FDA） hydrolase are the highest in the bio-stimulation-bio-augmentation combination process；While the enzyme activities of soil urease and phosphatase are the highest in the bio-stimulation process.

diesel contaminated soil；bioremediation；bio-stimulation；bio-augmentation；enzyme activity

X172

A

1006 - 1878（2015）02 - 0142 - 05

2014 - 09 - 02；

2014 - 12 - 10。

高闖（1987—），男，遼寧省撫順市人，碩士生，電話(huà) 18741390633，電郵 573088322@qq.com。