高建華，王文斌，劉建東，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

受空間誘變育種（微重力、強(qiáng)輻射和高真空等復(fù)雜因素）的啟示［1］，人們嘗試研究利用大于地球重力加速度的超重力環(huán)境進(jìn)行作物誘變育種。研究顯示，超重力能夠從不同水平影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。比如從植物器官發(fā)育水平研究，發(fā)現(xiàn)超重力能夠抑制幼苗胚軸的伸長(zhǎng)。在細(xì)胞水平，超重力處理能導(dǎo)致細(xì)胞壁硬度增加，延展性降低，液泡的pH值提高，細(xì)胞骨架微管量增加等等［2～7］。從基因水平上講，超重力還能使基因表達(dá)水平發(fā)生變化［2，8～10］。另外，也有直接證據(jù)觀察到超重力對(duì)基因組DNA的直接影響。比如，18×g的超重力處理人腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA序列的圖譜的變化［11］。

一般認(rèn)為，植物對(duì)超重力的反應(yīng)系統(tǒng)是位于質(zhì)膜上的機(jī)械力感受系統(tǒng)，比如NADH氧化酶、Ca2＋／CaM 系統(tǒng)等［12～14］。而前述超重力導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA序列的變化，也可能是機(jī)械力對(duì)遺傳物質(zhì)的直接或間接的損傷引起的。Tauchi等檢測(cè)到超重力作用可直接干擾DNA雙鏈斷裂后的同源重組效率［15］。Pedroso等［16］指出，超重力處理使高涼菜屬植物（Kalanchoe daigremontiana）的DNA斷裂，并且葉綠體DNA的斷裂要早于核DNA。為進(jìn)一步證明該觀點(diǎn)，我們?cè)O(shè)置不同的離心條件，模擬不同的超重力環(huán)境，對(duì)模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的種子進(jìn)行超重力處理。對(duì)其M2代植株進(jìn)行 RAPD－PCR（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）檢測(cè)，期望直接篩選到DNA突變位點(diǎn)，并確認(rèn)其核苷酸序列變化，進(jìn)一步找到超重力導(dǎo)致遺傳物質(zhì)突變的直接證據(jù)，并分析其潛在機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為野生型擬南芥Arabidopsis thaliana cv.Columbia的種子（由英國(guó)諾丁漢大學(xué)擬南芥儲(chǔ)藏中心提供）。

1.2 擬南芥的超重力處理及栽培

將擬南芥干種子用75%的酒精浸泡消毒30 s，清洗干凈，用水浸種2h。然后分裝至1.5mL的離心管中，按不同的條件離心處理（參照表1）。處理完畢，將種子撒播在預(yù)先濕潤(rùn)的營(yíng)養(yǎng)塊上。最后置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（培養(yǎng)條件16h光照，23℃；8h黑暗，20 ℃）。

表1 擬南芥種子的超重力處理?xiàng)l件Table 1 The processing conditions for the Arabidopsisthaliana seeds

1.3 擬南芥基因組DNA的提取與檢測(cè)

將上述不同處理誘變的擬南芥種子播種，為M1代。種子收獲后，繼續(xù)分別種植，獲得M2植株。對(duì)不同處理的M2代擬南芥，分別取葉片0.5 g，并以CTAB法提取基因組DNA（對(duì)于同一處理的擬南芥，取不同植株上的葉片，等重量混合后，共取0.5g）。將樣品葉片在液氮中研磨，加入65℃預(yù)冷的CTAB提取緩沖液［2% （w／v）CTAB，100 mmol·L－1的 Tris－HCl，500mmol·L－1的 EDTANa2，1.4mol·L－1的 NaCl，1%（v／v）的β－巰基乙醇，以及2%（w／v）的聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0］?；靹蚝螅糜?5℃的水浴中，溫浴40 min，期間不時(shí)地顛倒混勻。加入等體積的氯仿異戊醇（24∶1），溫和顛倒2min，12 000rpm離心10 min。取上清，重復(fù)氯仿異戊醇提取步驟。取離心后的上清，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，置－70℃冰箱30min。4℃，12 000rpm離心5 min，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀3次，風(fēng)干后，加入100μL TE緩沖液（10mmol·L－1的 TriSHCl，1mmol·L－1的 EDTANa2，pH 8.0。）溶解DNA。向DNA溶液中加入5μL10mmol·L－1RNase A，37℃溫浴20min。最后，取3μLDNA溶液，在0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA的完整性。另外，取5μL提取的DNA，用滅菌雙蒸水50倍稀釋，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度。其余的DNA置于4℃，備用。

1.4 不同處理擬南芥的RAPD檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)選用20條隨機(jī)引物（見(jiàn)表2，TaKaRa公司）對(duì)不同處理的M2代擬南芥，進(jìn)行了RAPD分析。RAPD－PCR使用的反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer，2.5μL；MgCl2（25mmol·L－1），2.5μL；dNTPs Mixture（各2.5mmol·L－1），2μL；引物（20μmol·L－1），1μL；Taq（5U·μL－1，Takara TaqTM，堿基錯(cuò)配率介于萬(wàn)分之四到五之間），0.125μL；模板 DNA（負(fù)對(duì)照用水代替 DNA），1 μL；雙蒸水補(bǔ)齊25μL。PCR反應(yīng)條件為，首先94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（94℃變性45s，36℃退火45s，72℃延伸1min），最后，72℃保持10min。

將PCR產(chǎn)物取5μL，在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后使用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每條引物，至少進(jìn)行3次重復(fù)。

表2 本實(shí)驗(yàn)使用的引物序列Table 2 The primers for RAPD analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 M2代擬南芥的RAPD分析

以未經(jīng)處理的野生型擬南芥為對(duì)照，對(duì)6個(gè)處理的M2代擬南芥的DNA進(jìn)行RAPD分析。實(shí)驗(yàn)使用20條RAPD引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，大部分引物未檢測(cè)出差異，只有3條引物找出了穩(wěn)定的差異性。使用引物M的PCR反應(yīng)中，處理2缺失了一條約1.3kb的條帶；使用引物S的PCR反應(yīng)中，處理1出現(xiàn)一條略小于750bp的條帶；使用引物T的PCR反應(yīng)中，處理5檢測(cè)出一條約460bp的條帶（圖1）。

圖1 不同處理擬南芥M2代植株的RAPD多態(tài)性分析Fig.1 The results of the RAPD－PCR analysis for the M2generation plants注：圖1中顯示分別使用引物M、S和T篩選出的RAPD圖譜變化。其中，“CK”泳道為陰性對(duì)照，使用未處理的擬南芥基因組DNA為模板；“M”泳道為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子，從大到小依次為2 000、1 000、750、500、250和100bp；“1～6”泳道樣品分別來(lái)自處理1～6（見(jiàn)表1）的M2代植株。Note：Figure 1shows the RAPD map of samples in different treatment groups with primer M，S and T.Lane CK，the negative control using the DNA of wild Arabidopsis thalianaas the template for PCR.Lane M，the DNA marker including 2 000，1 000，750，500，250and 100bp bands.Lane 1～6，RAPD－PCR results of M2generation plants whose parents were processed in the different hypergravity conditions，respectively（processing number 1to 6，Table 1）.

2.2 部分特異性片段的序列分析

對(duì)在RAPD－PCR中篩選出來(lái)部分特異性片段（引物T，處理2）進(jìn)行了測(cè)序分析。處理2中，使用引物T檢測(cè)到一條約460bp的特異性條帶，將該片段回收，純化并測(cè)序。然后在線（http：／／www.arabidopsis.org／）進(jìn)行 Blastx，發(fā)現(xiàn)該序列全長(zhǎng)464bp，與擬南芥線粒體中琥珀酸脫氫酶的鐵硫蛋白亞基 AT3G27380.1（3號(hào)染色體）、AT5G40650.1（5號(hào)染色體）和 AT5G65165.1（5號(hào)染色體）的氨基酸序列表現(xiàn)出較高的同源性（相似性依次為78%，76%和70%）。

進(jìn)一步分析其核酸序列，發(fā)現(xiàn)該464bp條帶的1～336bp與AT3G27380.1基因第一個(gè)外顯子3'序列匹配較好，而337～464bp序列與該基因第一內(nèi)含子3'端至第二外顯子5'附近的序列匹配，但是同源性略低（圖2）。

圖2 464bp特異性條帶序列與AT3G27380.1基因的對(duì)比圖Fig.2 The alignment of the DNA sequence of 464bp band and AT3G27380.1gene注：“464bp”表示處理5中，使用引物T篩選到的特異性條帶，共464bp。“AT3G27380.1”基因是擬南芥琥珀酸脫氫酶中的鐵硫蛋白亞基基因基因組DNA序列，圖中只列出該基因第251～1 400bp處的序列（從起始密碼子ATG對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)計(jì)數(shù)）。陰影部分為相同序列。兩個(gè)三角形分別標(biāo)注出第一個(gè)內(nèi)含子的起始和結(jié)束位點(diǎn)。Note：“464bp”represents the sequences of the extra 464bp band detected by the primer T in the samples of processing number 5.“AT3G27380.1”shows the 251～1400nucleotides of genomic DNA sequences of the Fe－S protein subunit of the succinate dehydrogenase genes（counting started from the A of the start codon ATG）.The matched sites are shaded and the black triangles indicate the boundaries of the first intron of the AT3G27380.1gene.

以上比對(duì)結(jié)果暗示，2000×g的離心力處理擬南芥種子4h后，基因組DNA在琥珀酸脫氫酶中的鐵硫蛋白亞基基因處產(chǎn)生缺失突變，導(dǎo)致其第一內(nèi)含子部分丟失。同時(shí)，產(chǎn)生了一系列的點(diǎn)突變。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同的重力加速度和持續(xù)時(shí)間的組合，對(duì)擬南芥種子進(jìn)行超重力處理，并對(duì)處理過(guò)的材料進(jìn)行DNA水平的檢測(cè)。20條RAPD引物，共檢測(cè)出3處突變。即，引物M檢測(cè)出處理2中的擬南芥材料缺失了一條約1.3kb的條帶；引物S檢測(cè)出處理1中的材料多擴(kuò)增出一條略小于750bp的條帶；引物T檢測(cè)出處理5中的擬南芥多擴(kuò)增出一條464bp的條帶。該結(jié)果證明，超重力處理能夠?qū)M南芥基因組造成直接的影響。類(lèi)似的結(jié)果已在人腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)［11］。

將處理5中出現(xiàn)的464bp的特異性條帶進(jìn)行測(cè)序并在線比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該處理可能導(dǎo)致擬南芥粒體中琥珀酸脫氫酶的鐵硫蛋白亞基突變。而擬南芥共有三個(gè)相關(guān)基因，分別為AT3G27380.1、AT5G40650.1和 AT5G65165.1。Blastx分析，該464bp片段與AT3G27380.1基因的編碼蛋白同源性最高。該結(jié)果暗示，此突變位點(diǎn)可能位于3號(hào)染色體上。當(dāng)然，由于該片段序列本身存在較多的突變位點(diǎn)，且與 AT5G40650.1和 AT5G65165.1基因也有一定的同源性，因此也有可能真正的突變位點(diǎn)位于5號(hào)染色體上相應(yīng)的位置。要精確該突變位點(diǎn)仍需要進(jìn)一步的檢測(cè)和分析。

另外，該464bp特異性條帶的測(cè)序結(jié)果，說(shuō)明該擬南芥突變體很有可能是琥珀酸脫氫酶的鐵硫蛋白亞基編碼基因的第一個(gè)內(nèi)含子缺失。結(jié)合已有報(bào)道［12，16］，我們推測(cè)超重力引發(fā)突變的重要機(jī)理可能是導(dǎo)致基因組DNA片段的斷裂或丟失。同時(shí)，由于超重力影響同源重組的效率，從而使機(jī)體在修復(fù)這種較為嚴(yán)重的損傷時(shí)，更多地使用易錯(cuò)修復(fù)（error－prone repair），最終導(dǎo)致片段缺失及缺失位點(diǎn)兩側(cè)的序列嚴(yán)重突變。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了一系列重力加速度條件，通過(guò)RAPD引物對(duì)處理后的材料進(jìn)行突變篩選。結(jié)果顯示，超重力作用能夠直接引發(fā)遺傳物質(zhì)——DNA的突變，為超重力誘變育種的可行性提供了直接支持。當(dāng)然，由于篩選到的突變數(shù)量較少，暫時(shí)無(wú)法揭示不同程度的重力加速度對(duì)基因組DNA的影響規(guī)律，因此，仍需要更全面的篩選和研究。

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