孫理軍 孫耀光 王曉棣 王 興 孫瑜嬬 張 琪 陜西中醫(yī)藥大學(xué)（咸陽712046）

腎藏精舍志、主骨、生髓、通腦，歷代醫(yī)家無論從理論探討，還是臨床實踐方面，均認(rèn)為腎虛體質(zhì)的一個重要表現(xiàn)特征是學(xué)習(xí)記憶能力的減低［1］。大量研究證實記憶和意志等中樞神經(jīng)功能涉及海馬等與生命體精神心理調(diào)節(jié)密切相關(guān)的腦區(qū)。BDNF通路具有調(diào)節(jié)海馬突觸傳遞和突觸可塑性的作用，通過誘發(fā)并維持海馬、皮質(zhì)長時程增強(qiáng)效應(yīng)（Long－term Potentiation，LTP），參與中樞神經(jīng)功能，是判斷腎虛體質(zhì)的重要指標(biāo)。

1 材料與方法 1.1 實驗動物 8周齡清潔級SD雌、雄大鼠（體重200～240g），購自西安交大醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（生產(chǎn)許可證SCXK（陜）2007－001）。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食，不限飲水，室溫。雌雄土貓各1只，3月齡，兇狠善叫，鮮活大鼠喂食，不限飲水，室溫。

1.2 實驗主要藥物、試劑及儀器 左歸丸（批號：100306）、右歸丸（批號：110309）、水合氯醛、RIPA蛋白裂解液試劑盒、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、SDS－PAGE凝膠試劑盒、脫脂牛奶、TBST、BDNF、TrkB、CaMK2、CREB一抗、二抗、ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光試劑盒（均購自勇毅試劑公司）；特制貓、鼠籠、電子精密天平、低溫高速離心機(jī)（北京時代北利公司）、恒溫箱、酶標(biāo)儀（562nm）、電泳儀（美國BioRad公司）、凝膠成像儀（上海復(fù)日科技）等。

1.3 動物分組及模型建立［2］適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按雄性與雌性大鼠1∶2比例合籠交配。成功受孕后將孕母鼠隨機(jī)分為對照組（n＝10）和腎虛組（n＝10）。腎虛組孕鼠置于特制鼠籠，于早8：00至晚7：00置于貓籠旁進(jìn)行恐嚇，同時在貓籠內(nèi)放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁處于恐慌狀態(tài)；對照組孕鼠不作處理，非恐嚇時間兩組均置于同處并確保其他非處理因素一致?？謬樦羶山M孕鼠產(chǎn)子，將仔鼠飼養(yǎng)4周進(jìn)行分組，空白組（n＝10）從對照孕鼠所產(chǎn)仔鼠中隨機(jī)選取；腎虛組孕鼠所產(chǎn)仔鼠隨機(jī)選取30只，分為模型組（n＝10）、左歸丸（n＝10）、右歸丸組（n＝10），繼續(xù)對此三組仔鼠進(jìn)行恐嚇并持續(xù)1個月?？瞻捉M仔鼠零刺激，非恐嚇時間四組仔鼠均置同處減小非處理因素。

1.4 給藥方法與劑量 按文獻(xiàn)折算［3］，大鼠用藥量約為人6.25倍。左歸丸每10丸含生藥量1g，成人每日服生藥18g，則大鼠每日服生藥為1.875g／kg，蒸餾水配成1.875g／mL混懸液備用。右歸丸每8丸含生藥3g，成人每日服生藥9g，則大鼠每日服生藥為0.9375g／kg，蒸餾水配成0.09375g／mL混懸液備用。對仔鼠恐嚇同時開始灌胃，藥物組給予上述制備好的混懸液，空白組和模型組給予等量生理鹽水10mL／kg，1d1次，每周用藥5d停2d，連續(xù)2月。

1.5 Morris水迷宮實驗 各組仔鼠5周齡時進(jìn)行Morris水迷宮實驗，實驗第1天為適應(yīng)訓(xùn)練，每只仔鼠在池中游泳120秒。第2～5天為學(xué)習(xí)階段，隨機(jī)選取一象限將大鼠頭朝池壁緩緩放入水中，記錄大鼠找到水下平臺時間，若超過60s未找到者，則引導(dǎo)至平臺停留10s，每只大鼠4次／d，中間間隔15～20min。實驗第6天為測試階段：將大鼠分別從四個不同象限放入水中，找到平臺后令其休息10s，若120s內(nèi)找不到平臺則記時120s并將其引致平臺休息10s，從下一象限繼續(xù)試驗，以大鼠四次測試平均值做為測試成績，記錄各組大鼠尋找平臺所花費(fèi)的時間即潛伏期（s）、總路程（cm）和第一次穿越目標(biāo)區(qū)所用時間（s）。

1.6 免疫印跡實驗 首先提取海馬組織蛋白，仔鼠用藥2個月后禁食12h稱重，7%水合氯醛0.05mL／kg腹麻，斷頭冰上取海馬稱重，按照RIPA蛋白裂解試劑盒制備裂解液并加入13μL／mg裂解液冰上勻漿，12000rpm 4℃離心10min，取上清分裝，－80℃凍存。然后進(jìn)行相關(guān)準(zhǔn)備及檢測。

1.6.1 蛋白定量檢測：BCA蛋白定量試劑盒檢測：冰浴上制備好準(zhǔn)備液和標(biāo)準(zhǔn)品，96孔板上25μL／孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品并做兩個復(fù)孔，等量去離子水做空白對照，等量10倍去離子水稀釋蛋白樣品上樣；每孔加200μL配置好的BCA混合工作液，混勻后37℃孵育30min；酶標(biāo)儀562nm讀取吸光值計算蛋白濃度；loading buffer稀釋樣品使其終濃度5μg／μL。

1.6.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：配置10%分離膠和4%積層膠，待膠凝固后加入Maker和樣品各15uL；按60V電壓分離膠和90v電壓積層膠電泳。

1.6.3 轉(zhuǎn)膜：按順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，冰浴380A轉(zhuǎn)膜約1.5h；取出PVDF膜，1%麗春紅染色后現(xiàn)清晰、連續(xù)粉紅色條帶；去離子水洗去麗春紅，將膜放入ddH2O平皿中，搖床80rpm震蕩清洗5min。

1.6.4 抗體雜交：將膜置入TBST配置的5%脫脂奶粉平皿中搖床震蕩，室溫封閉1h；塑料袋加入1∶150比例TBST稀釋一抗，PVDF膜置入塑料袋封口，4℃冰箱過夜；取出膜清洗，加入TBST 1∶1000稀釋的二抗封口，搖床室溫封閉1h。

1.6.5 發(fā)光檢測：ECL發(fā)光試劑盒避光制備發(fā)光工作液，暗室中壓片、顯影液顯影、清洗后定影；凝膠成像儀照相、全自動攝影儀拍攝掃描并測定光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 將蛋白灰度值與內(nèi)參β－actin灰度值比 較，得 出 BDNF／β－actin、TrkB／β－actin、CaMK2／β－actin 和CREB／β－actin比值，反應(yīng)各樣品中蛋白的表達(dá)水平。SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 腎虛質(zhì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的變化（Morris水迷宮實驗） ①潛伏期：模型組長于空白組、左歸丸、右歸丸組（P＜0.05）；左歸丸、右歸丸組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。②總路程：模型組長于空白組、左歸丸、右歸丸組（P＜0.05）；左歸丸、右歸丸組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。③第一次穿越時間：模型組略長于其他三組，與右歸丸組相比差異有顯著性（P＜0.05）；但與空白組和左歸丸組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 Morris水迷宮參數(shù)比較（±s，n＝10）

表1 Morris水迷宮參數(shù)比較（±s，n＝10）

42.9±3.1 719.2±50.9 16.9±0.9模型組 65.3±10.7 1184.4±116.3 18.1±1.8左歸丸組 44.2±8.6 916.5±160.5 17.3±2.5右歸丸組）空白組48.7±9.1 813.3±140.4 16.2±2.1

2.2 腎虛質(zhì)大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB和CaMK的表達(dá)變化 使用免疫印跡法對各組大鼠的海馬組織的BDNF、TrkB、CREB和CaMK的表達(dá)進(jìn)行分析，如圖1所示，腎虛質(zhì)模型組的海馬BDNF、TrkB、CaMK2及CREB表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，而左歸丸及右歸丸干預(yù)后2組大鼠的BDNF、TrkB、CaMK2及CREB表達(dá)出現(xiàn)部分升高。對各組蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如表2所示，與空白組比較，模型組BDNF、TrkB、CaMK2、CREB蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.05）；左歸丸組的BDNF、TrkB、、CREB略高于模型組但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），CaMK2顯著高于模型組（P＜0.05）。右歸丸組BDNF、TrkB、CREB高于對照組但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），CaMK2顯著性高于模型組（P＜0.05）。左、右歸丸組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 海馬BDNF、TrkB、CREB和CaMK的含量變化（±s，n＝10）

表2 海馬BDNF、TrkB、CREB和CaMK的含量變化（±s，n＝10）

0.75±0.22 0.62±0.21 1.03±0.05 0.88±0.24組別 BDNF／β－actin TrkB／β－actin CaMK2／β－actin CREB／β 0.92±0.12 0.89±0.30 1.14±0.07 0.97±0.22模型組 0.59±0.22 0.58±0.22 0.53±0.06 0.83±0.26左歸丸組 0.79±0.23 0.72±0.23 1.01±0.05 0.91±0.30右歸丸組－actin空白組

3 討 論 腎虛體質(zhì)是各類人群常見的體質(zhì)類型之一，是以腎中精氣虧虛，腎臟功能低下為主要特征的一種體質(zhì)狀態(tài)。腎藏精舍志、主骨、生髓、通腦，歷代醫(yī)家無論從理論探討，還是臨床實踐方面，均認(rèn)為腎虛體質(zhì)的一個重要表現(xiàn)特征是學(xué)習(xí)記憶能力的減低。學(xué)習(xí)和記憶過程的基礎(chǔ)是神經(jīng)元之間的連接，即突觸在形態(tài)和功能上的改變，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）具有防止神經(jīng)元死亡的功能，是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種，主要由大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元產(chǎn)生；酪氨酸激酶B（TrkB）為BDNF的特異性受體，當(dāng)BDNF與TrkB結(jié)合可調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)信號［4］。研究阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）模型大鼠的實驗發(fā)現(xiàn)，鈣／鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶II（CaMK II）－α與 AD關(guān)系密切［5］。CaMK II－β蛋白參與突觸構(gòu)建過程，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的恢復(fù)，CaMLII－β降低表達(dá)則造成認(rèn)知功能障礙［6］。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）作為核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其本身也可被BDNF激活，增強(qiáng)CREB功能可明顯增強(qiáng)動物的長期記憶能力［7］。

實驗結(jié)果顯示，腎虛質(zhì)大鼠海馬BDNF蛋白表達(dá)下降，其相關(guān)信號分子TrkB、CaMK2、CREB亦出現(xiàn)一定程度的降低，補(bǔ)腎方藥左歸丸、右歸丸在一定程度上可以上調(diào)其下降的異常表達(dá)，證明補(bǔ)腎中藥在腎虛質(zhì)腦功能減退方面可通過改善神經(jīng)營養(yǎng)因子低表達(dá)使其恢復(fù)正常從而起到改善腎虛質(zhì)衰退的腦功能。提示腎虛質(zhì)大鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬BDNF及其相關(guān)分子的表達(dá)變化，是腎藏志理論的重要神經(jīng)生物學(xué)重要指標(biāo)。對于預(yù)防亞健康狀態(tài)的產(chǎn)生以及對老年性腦功能疾病和多種慢性疾病的防治具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

［1］ 薛 昶，孫理軍，郝 蕊.腎虛體質(zhì)大鼠生理指標(biāo)變化的實驗研究［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（4）：505－506.

［2］ 孫理軍，李翠娟，王 震，等.腎虛質(zhì)實驗動物模型的構(gòu)建方法與評價［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）：247－249.

［3］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：332－335.

［4］ Kilein R，Nanduri V，Jing SA，et al.The trkB tyrosine protein kinase is a receptor for brain－derived neurotrophic factor and neurotrophin－3［J］.Cell，1991，66：395－403.

［5］ 胡 慧，王 平，孔明望，等.補(bǔ)腎化痰方藥對阿爾茨海默病模型大鼠腦組織鈣／鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶II－α活性的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（5）：786－787.

［6］ 唐敬龍，高維娟，李玉明，等.補(bǔ)陽還五湯對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬組織ERK2與CaMK IIβ蛋白表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26（9）：1722－1727.

［7］ Yin JC，Del Vecchio M，Zhou H，et al.CREB as a memory modulator：induced expression of a dCREB2activator isoform enhances long－term memory in Drosophila［J］.Cell，1995，81（1）：107－115.