方秋華，肖田安，伍宏凱，胡苑玲

（廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗所，廣州510230）

高效液相色譜法測定飼料中艾司唑侖的含量

方秋華，肖田安?，伍宏凱，胡苑玲

（廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗所，廣州510230）

建立了高效液相色譜法測定預(yù)混合飼料、配合飼料和濃縮飼料中艾司唑侖含量的檢測方法。試樣用正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）提取，經(jīng)MCX固相萃取柱進一步凈化，采用反相高效液相色譜－紫外檢測法進行定量分析。飼料中艾司唑侖的檢測限為0.1 mg／kg，定量限為0.25 mg／kg。在飼料中添加0.25、0.5、2.5 mg／kg水平的藥物回收試驗中，平均回收率均在82.8%～105.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～8.40%。該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于飼料中艾司唑侖含量的分析檢測。

艾司唑侖；飼料；高效液相色譜

艾司唑侖（又稱舒樂安定，Estazolam，EZL）屬苯二氮卓類抗焦慮鎮(zhèn)靜催眠藥，在人醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用于催眠、鎮(zhèn)靜、抗驚厥和抗精神失常。該類藥物能使動物平靜，減輕機體對不良刺激的應(yīng)激，限制動物的運動，從而減少動物維持體能的營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有益于增重。故有些不法分子在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下，可能在畜禽養(yǎng)殖中違規(guī)添加使用，以提高飼料轉(zhuǎn)化率。在飼料中濫用此類藥物將使其原型藥物和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動物源性食品中，導(dǎo)致畜產(chǎn)品品質(zhì)降低，人食用后會造成對中樞神經(jīng)系統(tǒng)等的不良影響，危害身體健康。農(nóng)業(yè)部176號公告［1］禁止在飼料和動物飲用水中使用包括艾司唑侖在內(nèi)的精神類藥物。已有文獻報道用高效液相色譜法測定艾司唑侖的血藥濃度［2－8］，但前處理方法較簡單，無法滿足基質(zhì)較為復(fù)雜的飼料樣品的測定要求，也有用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）測定動物組織［9－11］、飼料［12－14］、血液［15－16］及尿液［17］中多種精神類藥物，但未有關(guān)于飼料中艾司唑侖的高效液相色譜檢測方法報道。本研究旨在建立一種高效液相色譜法測定飼料中艾司唑侖，以滿足對飼料非法添加的監(jiān)控要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260型液相色譜儀，美國安捷倫公司；SUPELCOL Discovery C18色譜柱，美國Supelco公司；Mach 1.6 R冷凍型離心機，美國Thermo公司；MCX固相萃取柱，60 mg／3 mL，美國Waters公司；Millipore純水機。

艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品購自日本W(wǎng)AKO公司，乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純（德國 CNW公司），正己烷、二氯甲烷、氨水、磷酸二氫鉀，均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠），水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 準(zhǔn)確稱取艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品約50 mg，于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃保存，備用。

1.3 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取試料（2.0±0.02）g，于50 mL離心管中，加入水20 mL，用100 g／L碳酸鈉水溶液調(diào)pH至8.5～9.0，加入氯化鈉約1 g。準(zhǔn)確加入正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）15 mL，中速振蕩10 min后，5000 r／min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入梨形瓶中。殘渣再用15 mL正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）重復(fù)提取一次，合并提取液，在（35± 2）℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用甲醇5 mL分兩次溶解梨形瓶中的殘留物，備用。

MCX固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上述備用液過柱，用3 mL 2%甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，用5%氨水甲醇溶液6 mL洗脫，收集洗脫液，45℃下氮氣吹干，加入1 mL甲醇震蕩溶解殘渣，用0.45 μm的濾膜濾過，濾液供液相色譜測定。

1.4 儀器測定 高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱為SUPELCOL Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm），或相當(dāng)者；流動相為乙腈（A），0.4%磷酸二氫鉀溶液（B）；梯度洗脫程序為：0～10 min，44% A；10～11 min，44%A～75%A；11～15 min，75%A；15～17 min，75%A～44%A；17～20 min，44%A。流速1.0 mL／min；檢測波長222 nm；進樣量20 μL；柱溫30℃。

2 結(jié)果

2.1 光譜圖及色譜圖 在所確定的色譜條件下，艾司唑侖最大吸收波長見光譜圖（圖1），艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2，各空白飼料樣品添加艾司唑侖（0.5 mg／kg）所獲得的色譜圖見圖3～圖5。

圖1 艾司唑侖光譜圖

圖2 艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（1.0 μg／mL）

圖3 雞預(yù)混料空白添加艾司唑侖色譜圖（0.5 mg／kg）

圖4 雞配合料空白添加艾司唑侖色譜圖（0.5 mg／kg）

圖5 雞濃縮料空白添加艾司唑侖色譜圖（0.5 mg／kg）

2.2 線性范圍與檢出限 精密吸取艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液（50 μg／mL）適量，用甲醇稀釋成濃度為0.20、0.50、1、2、5、10、20 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在所確定的色譜條件下，從低濃度到高濃度進樣，每一濃度進樣三針，將測得的峰面積的平均值（Y）與對應(yīng)濃度（X）擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表1）。

采用空白飼料添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3項方法進行處理，然后上機檢測，以信噪比（S／N）≥3確定檢測限，以S／N≥10確定定量限。結(jié)果見表1。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度 對空白飼料分別以0.25、0.5、2.5 mg／kg艾司唑侖3個濃度水平進行添加回收試驗，每個濃度平行5份，同日測定，連續(xù)做3 d，結(jié)果見表2。艾司唑侖在各飼料樣品中的平均回收率在82.8%～105.9%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01%～7.78%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～8.40%。

表1 艾司唑侖在各飼料中的線性方程、檢測限和定量限結(jié)果表

表2 艾司唑侖在各飼料樣品中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表

樣品類型 添加濃度／（mg·kg－1）回收率X（RSD）／% 1 2 3X（RSD）／%雞濃縮料0.25 91.2（3.47） 87.8（3.01） 87.2（1.52） 88.7（3.31）0.5 88.5（4.78） 88.2（6.13） 88.8（1.21） 88.5（4.21）2.5 82.8（3.77） 89.3（7.13） 83.8（3.61） 85.3（5.96）豬濃縮料0.25 91.6（1.38） 86.3（1.04） 87.9（1.40） 88.6（2.84）0.5 88.1（1.15） 90.6（1.29） 89.5（1.02） 89.4（1.62）2.5 93.5（1.89） 90.9（2.53） 90.3（1.56） 91.6（2.47）

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化 對于色譜柱的選擇，已報道的文獻資料表明精神類藥物在C18色譜柱上有較好的保留性質(zhì)，所以本研究利用實驗室現(xiàn)有的條件，主要比較了 SUPELCOL Discovery C18（150× 4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire C18（150×4.6 mm，5 μm）和SUPELCOL Discovery C18（250×4.6 mm，5 μm）這三種色譜柱。發(fā)現(xiàn)艾司唑侖在這三種色譜柱上均具有較好的保留性質(zhì)，但在Waters C18色譜柱上峰型較寬，在SUPELCOL Discovery C18（150 ×4.6 mm，5 μm）色譜柱上所得峰型雖好，出峰時間太早，容易受雜質(zhì)峰干擾，所以最后選用SUPELCOL Discovery C18（250×4.6 mm，5 μm）。

對于流動相的優(yōu)化，本研究主要考察了甲醇或乙腈（有機相）與乙酸銨緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液（不同pH條件下）或超純水（水相）組成的流動相體系對分析結(jié)果的影響。由0.4%KH2PO4（pH 4.5）、KH2PO4／K2HPO4（pH 5.8）、H3PO4／NaH2PO4（pH 6.4）等組成的磷酸鹽緩沖溶液、乙酸銨緩沖液（pH 6.84）與甲醇或乙腈組成的一定比例的流動相體系中，能有效地將艾司唑侖與飼料中的其他組分分離。其中以乙腈－0.4%KH2PO4（pH 4.5）流動相體系進行梯度洗脫時能有效地將藥物峰與雜質(zhì)峰分離，且得到最為優(yōu)異的峰型，對稱，不拖尾。

對于波長的選擇，本研究在200～400 nm范圍內(nèi)對艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液進行全掃描，在222、225、230、240、254 nm處有5個依次變低的吸收峰，最終選擇222 nm進行測定。

3.2 樣品前處理方法的研究 對于苯二氮卓類藥物的殘留檢測，已報道的文獻常以乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙醚、乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷、氯仿等為提取溶劑。本研究根據(jù)艾司唑侖的理化性質(zhì)并參考文獻主要考察了乙酸乙酯、乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷等溶劑或其混合物的提取效果，發(fā)現(xiàn)以正己烷－二氯甲烷（1∶1，V／V）為提取溶劑時，提取回收效果最好，故以此為提取溶劑。目前對于苯二氮卓類藥物的凈化主要還是采用固相萃取法，主要考察了MCX、HLB、C18以及硅酸鎂小柱等實驗室常用小柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)在相同條件下艾司唑侖在MCX小柱上具有最好的保留效果，回收率可達(dá)95%甚至更高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也較好，而用其余三種小柱凈化后所得回收率不足10%，所以選擇MCX小柱對樣品進行凈化處理。

本文建立的HPLC－紫外檢測法，能快速檢測預(yù)混料、配合料和濃縮料中艾司唑侖含量。該方法前處理簡便易行，靈敏度高，精密度好，回收率高，重復(fù)性好，可滿足飼料中艾司唑侖的分析要求。

［1］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第176號.禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種［S］.

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（編 輯：侯向輝）

Determination of Estazolam in Feeds by High Performance Liquid Chromatography

FANG Qiu－h(huán)ua，XIAO Tian－an?，WU Hong－kai，HU Yuan－ling
（Guangdong Institute for Veterinary Drugs and Feedstuffs Control，Guangzhou510230，China）

A confirmatory method has been developed and validated for the determination of estazolam（EZL）in premix，compound feed and concentrate feed using high performance liquid chromatography（HPLC）.The analyte was extracted from feeds using hexane－dichloromethane（1∶1，V／V），and then the sample extracts were purified by MCX solid－phase extraction.The analyte was analyzed by HPLC－UV.The limit of detection was 0.1 mg／kg for EZL，with quantification limit of 0.25 mg／kg.Recoveries were in the range of from 82.8%to 105.9%from feeds fortified at the 0.25，0.5，2.5 mg／kg levels，and the mean intra－laboratory reproducibility ranged from 1.62%to 8.40%.The developed method was sensitive and specific for the detection of estazolam in feeds.

estazolam；feeds；high performance liquid chromatography（HPLC）

2015－02－02

A

1002－1280（2015）04－0046－05

S859.83

2012農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定與修訂項目（168）

方秋華，碩士研究生，從事藥物殘留研究。

肖田安。E－mail：Xiaota＠hotmail.com