張繼州，韓 靜，張 寬，賀肇東，龐文生，胡 娟，3*

(1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122)

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考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定天花粉飲片水煎劑中蛋白質(zhì)含量

張繼州1，韓 靜1，張 寬2，賀肇東1，龐文生2，胡 娟1，3*

(1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福建省第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122)

目的：測(cè)定治療腦卒中及其后遺癥的經(jīng)典方栝樓桂枝湯中的君藥天花粉飲片水煎劑中蛋白質(zhì)的含量。方法：采用考馬斯亮藍(lán)法，利用考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)中的堿性基團(tuán)相結(jié)合的原理，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量待測(cè)溶液吸光度，得出其蛋白濃度。結(jié)果：濃度分別為0.5g/mL和1.0g/mL的天花粉飲片水煎劑，其蛋白質(zhì)含量分別為106.6μg/mL和132.6μg/mL。結(jié)論：該測(cè)定方法快捷、方便、靈敏度高，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

天花粉；栝樓桂枝湯；考馬斯亮藍(lán)法；蛋白質(zhì)；含量測(cè)定

天花粉是葫蘆科植物栝樓根的切片?！侗静菥V目》稱：“栝樓根，味甘微苦酸，酸能生津，故能止渴潤(rùn)枯，微苦降火，甘不傷胃?！碧旎ǚ鄣鞍?Tichosanthin，TCS)是從天花粉中提取的一組單鏈核糖體失活蛋白，具有抗孕引產(chǎn)、抑制腫瘤、抗病毒、免疫抑制等生理活性[1]。而天花粉作為治療腦卒中及其后遺癥的經(jīng)典方栝樓桂枝湯中的君藥，對(duì)于藥效有著關(guān)鍵性的影響[2-3]?？捡R斯亮藍(lán)(Coomassie BriLLiant BLue)法又稱Bradford法，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量，可以得到與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。該測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的優(yōu)點(diǎn)，是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法，因而得到廣泛的應(yīng)用[4]。本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定天花粉飲片水煎劑中的蛋白質(zhì)含量，為探究其藥理活性及臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。

1 儀器與材料

牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司)、考馬斯亮藍(lán)G250、95%乙醇、磷酸均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純、天花粉飲片(福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供)、去離子水。722光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 溶液制備

2.1.1 考馬斯亮藍(lán)溶液配制 取考馬斯亮藍(lán)G-250 20mg溶于10mL 95%乙醇，混勻，加入20mL 85%磷酸，最后用去離子水定容至200mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制 取2mg牛血清蛋白于去離子水中配成含蛋白質(zhì)2mg/mL母液。用去離子水梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，濃度分別為40、80、120、160、200μg/mL。

2.1.3 天花粉水煎劑制備 稱取藥材15、30g，分別加去離子水300mL，煎煮、濃縮成少于30mL的液體，用去離子水將濃縮液定容至30mL，獲得水煎劑中的生藥濃度為0.5g/mL、1.0g/mL。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 取上述配制的蛋白質(zhì)溶液各600μL于干凈試管內(nèi)，并標(biāo)明各管濃度，每管加入考馬斯亮藍(lán)溶液3mL，混勻。以去離子水作為空白對(duì)照，用去離子水對(duì)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行校正，標(biāo)準(zhǔn)空白管調(diào)零。按蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度由低到高進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3次，取平均值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 天花粉飲片水煎劑蛋白質(zhì)含量測(cè)定 取“2.1.3”中制得的水煎液，過(guò)濾，各取600μL于干凈試管內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)溶液3mL，混勻。用標(biāo)準(zhǔn)空白管進(jìn)行調(diào)零。不同樣品濃度各測(cè)定3次，取平均值，根據(jù)樣品吸光度值，由“2.2.1”所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)水煎劑蛋白濃度。

3 結(jié)果

3.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

依照“2.2.1”方法，測(cè)定濃度依次為40、80、120、160、200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的OD值(表1)；繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。其線性回歸方程式為：Y=0.004X+0.0886，R2=0.998 5。

表1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度測(cè)定值

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 天花粉飲片水煎劑蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

將濃度分別為0.5g/mL和1.0g/mL的天花粉飲片水

煎劑測(cè)得的吸光度OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出天花粉飲片水煎劑樣品中蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 天花粉水煎劑蛋白質(zhì)含量

4 討論

本研究結(jié)果所示，1.0g/mL濃度的天花粉飲片水煎劑中蛋白質(zhì)的濃度為0.5g/mL濃度的1.24倍，達(dá)不到2倍的理論值，故可能存在影響水煎劑蛋白含量的因素，如蛋白質(zhì)發(fā)生聚集或三級(jí)結(jié)構(gòu)在水煎過(guò)程中發(fā)生改變等,有待進(jìn)一步探究。

[1] 王飛 ,丁玉,陳明達(dá),等.天花粉蛋白的純化技術(shù)進(jìn)展及其藥理概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(1):29-30,41.

[2] 陳瑛玲,陳立典，陶靜.栝樓桂枝湯治療中風(fēng)后肢體痙攣的臨床研究[J].中醫(yī)臨床研究，2013,5(4):7-9.

[3] 黃慶勇，李煌，許文，等.君藥天花粉對(duì)復(fù)方栝樓桂枝湯中9種成分的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(12):57-60.

[4] 王孝平,邢樹(shù)禮.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3)：40-41．

(責(zé)任編輯：魏 曉)

2015-04-13

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1035-14)；福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013Y0047)；福建省教育廳項(xiàng)目(JB13090)；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題(XB2013037)

張繼州(1989-)，男，福建省中醫(yī)藥研究院研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼?/p>

胡娟(1962-)，女，福建中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R284.2

A

1673-2197(2015)17-0020-01

10.11954/ytctyy.201517010