朱琳欣，楊多猛，唐翔詡，王　媛，呂秀秀，李紅梅，嚴(yán)玉霞，戚仁斌，陸大祥，王華東△(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系0級(jí)本科班，病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，生物化學(xué)系，廣東廣州506)

α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑B-TH933抑制LPS處理的心肌細(xì)胞釋放TNF-α*

朱琳欣1▲，楊多猛2▲，唐翔詡2，王媛2，呂秀秀2，李紅梅2，嚴(yán)玉霞3，戚仁斌2，陸大祥2，王華東2△
(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1臨床醫(yī)學(xué)系2011級(jí)本科班，2病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，3生物化學(xué)系，廣東廣州510632)

［摘要］目的:觀察α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑B-HT933對(duì)脂多糖(LPS)刺激的心肌細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響，并初步分析其作用機(jī)制。方法:分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞。利用免疫熒光染色觀察心肌α(2A)-腎上腺素能受體的分布; B-HT933和/或LPS處理心肌細(xì)胞一定時(shí)間后，用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量、實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定心肌細(xì)胞TLR4和TNF-α mRNA的表達(dá)、Western blot分析心肌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)分子的磷酸化水平。結(jié)果:免疫熒光染色證實(shí)乳鼠心肌細(xì)胞中存在α(2A)-腎上腺素能受體。LPS以劑量和時(shí)間依賴的方式刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，0.1 μmol/L的B-HT933處理能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α mRNA的表達(dá)和TNF-α蛋白的產(chǎn)生。而且，BHT能抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞IκBα的磷酸化。結(jié)論:乳鼠心肌細(xì)胞上存在α(2A)-腎上腺素能受體，其激動(dòng)劑B-HT933可能通過抑制心肌細(xì)胞IκBα的磷酸化來減少LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生。

［關(guān)鍵詞］乳鼠;心肌細(xì)胞;脂多糖;α2-腎上腺素能受體

［修回日期］2015-08-25

▲并列第1作者

膿毒癥是危重病患者死亡的主要原因，盡管臨床治療措施不斷改進(jìn)，膿毒癥患者的死亡率仍高達(dá)25%～30%，如果發(fā)生膿毒癥性休克，其死亡率可超過50%［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，約50%的膿毒癥患者伴有心功能障礙，心功能障礙的發(fā)生是膿毒癥患者死亡的重要促進(jìn)因素［2］。雖然多種因素參與了膿毒癥性心功能障礙的發(fā)生機(jī)制，包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、心肌鈣代謝紊亂、心肌線粒體功能失調(diào)和心肌細(xì)胞凋亡等，但是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)激活導(dǎo)致腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生在膿毒癥性心功能障礙中發(fā)揮重要作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞上存在TLR4［3］，TLR4的激動(dòng)劑革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)與膿毒癥心功能障礙的發(fā)生機(jī)制有關(guān)，LPS可刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α［4］，TNF-α可直接抑制心肌細(xì)胞的功能［5］，給予TNF-α抗體阻斷TNF-α的作用可以顯著改善膿毒癥患者的心功能［6］。顯然，深入研究LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)理解膿毒癥心肌損傷具有重要意義。另一方面，膿毒癥時(shí)循環(huán)中兒茶酚胺濃度顯著上升［7］，兒茶酚胺激活心肌β1-腎上腺素能受體可增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α生成，加重心肌損傷［8］。有研究表明，胎鼠和成體大鼠心肌細(xì)胞上存在α2-腎上腺素能受體［9-10］，理論上，心肌細(xì)胞α2-腎上腺素能受體活化也可能影響心肌功能。然而，α2-腎上腺素能受體激活是否能影響LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞釋放TNF-α尚缺乏研究。因此，本研究首先檢測乳鼠心肌細(xì)胞α2A-腎上腺素能受體的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑BHT933對(duì)LPS刺激的心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響，并分析其作用機(jī)制。

材料和方法

1主要試劑

戊巴比妥鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、PBS液及胎牛血清均購自HyClone;含EDTA的0.125%的胰酶購自Gibco;大腸桿菌LPS(O55∶B5)、6-乙基-5，6，7，8-四氫-4H-17唑(4，5-d)氮雜卓-2-胺鹽酸［6-ethyl-5，6，7，8-tetrahydro-4H-oxazolo(4，5-d) azepin-2-amine dihydrochloride，B-HT933］和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)均購自Sigma;抗心肌肌鈣蛋白I (cardiac troponin I，cTnI)抗體、抗α2A-腎上腺素能受體抗體購自Abcam; Alexa FluorDyes標(biāo)記的熒光II抗購自Invitrogen; TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自R＆D; RNAiso Plus購于TaKaRa; real-time PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑購自Roche; PCR引物設(shè)計(jì)和合成由上海生工生物工程有限公司提供;抗核因子κBα抑制物(inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα)抗體、抗磷酸化IκBα (p-IκBα)抗體、抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)抗體、抗磷酸化ERK(p-ERK)抗體、抗c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體、抗磷酸化JNK(p-JNK)抗體、抗p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)抗體和抗磷酸化p38 MAPK(p-p38)抗體均購自CST。

2方法

2.1乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)與處理取出生1～3 d SPF級(jí)SD大鼠乳鼠［購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXX(粵) 2011-0015］，麻醉后用75%乙醇消毒8～10 s，取出心臟，將心室心肌組織剪碎，加入心臟組織量5～10倍體積的胰酶(0.125%)，37℃消化7 min。丟棄第一次上清，再次加入等量的胰酶消化5 min，收集細(xì)胞上清液于離心管內(nèi)，并加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM終止消化。重復(fù)收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞與DMEM混合，800 r/min，4℃離心7 min，獲得細(xì)胞沉淀。用含10%胎牛血清的DMEM懸浮細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾，將濾過的細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，純化心肌細(xì)胞。最后，將5.5×108cells/L接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)40 h。然后進(jìn)行如下處理:①用免疫熒光染色觀察心肌細(xì)胞α2A-腎上腺素能受體的分布;②觀察B-HT933對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響并分析其作用機(jī)制。心肌細(xì)胞用0.1 μmol/L B-HT933和/或不同劑量的LPS刺激不同時(shí)間，測定心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量、心肌細(xì)胞中TLR4 與TNF-α的mRNA表達(dá)以及相關(guān)信號(hào)分子的磷酸化水平。

2.2α2A-腎上腺素能受體免疫熒光染色培養(yǎng)的心肌細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍，0.25%的Triton X-100處理10 min。PBS清洗3次后，用1% BSA封閉1 h。隨后加入兔抗大鼠α2A-腎上腺素能受體和小鼠抗大鼠心肌肌鈣蛋白I的抗體，4℃過夜。洗片后，加入熒光II抗，室溫孵育1 h，最后加入DAPI室溫孵育10 min，封片后立即用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.3ELISA方法測定TNF-α含量取心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α含量。

2.4Real-time PCR測定心肌細(xì)胞TLR4和TNF-α 的mRNA表達(dá)LPS處理心肌1.5 h后，從培養(yǎng)箱中取出6孔板，按照加藥順序依次吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，加入RNAiso Plus 1 mL提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR條件為95℃10 s，60℃20 s，72℃20 s，所用引物見表1。

表1　Real-time PCR引物Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

2.5Western blotting檢測LPS和/或B-HT933處理心肌細(xì)胞30 min，冰上裂解細(xì)胞，4℃、16 000×g離心15 min，收集蛋白上清液，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［12］，進(jìn)行Western blotting分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1乳鼠心肌細(xì)胞上存在α2A-腎上腺素能受體

如圖1所示，cTnI抗體陽性染色呈現(xiàn)紅色熒光，顯示培養(yǎng)的細(xì)胞均為心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞核被DAPI染色，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。同時(shí)用抗α2A-腎上腺素能受體抗體染色，發(fā)現(xiàn)多數(shù)心肌細(xì)胞呈陽性，顯示為綠色熒光，其陽性染色主要分布在細(xì)胞膜和胞漿中。這些結(jié)果表明，乳鼠心肌細(xì)胞中存在α2A-腎上腺素能受體。

Figure 1.Immunofluorescence staining of α2A-adrenoceptor (α2A-AP) in neonatal rat cardiomyocytes.The cardiomyocytes were cultured for 40 h and then stained with antibodies against α2A-AR (green) and cTnI (red).The nuclei were stained with DAPI (blue).圖1乳鼠心肌細(xì)胞α2A-腎上腺素能受體免疫熒光染色

2 B-HT933抑制LPS處理的心肌細(xì)胞釋放TNF-α

LPS以劑量和時(shí)間依賴的方式刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，0.1 μmol/L的B-HT933處理能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生，見圖2。

Figure 2.The effects of B-HT933 (BHT)，a selective α2-adrenoceptor agonist，on TNF-α production in LPS-challenged cardiomyocytes.A: the cardiomyocytes were cultured for 40 h and then stimulated with 0.01，0.10 and 1.00 μmol/L LPS for 6 h; B: the cardiomyocytes were cultured for 40 h and then stimulated with 1.00 μmol/L LPS for 6 h and 12 h，respectively; C: the cardiomyocytes were cultured for 40 h and stimulated with BHT at concentration of 0.10 μmol/L or vehicle for 30 min，then with 0.10 μmol/L BHT plus 1.00 μmol/L LPS or 1.00 μmol/L LPS for another 6 h.TNF-α levels in the supernatants were examined by ELISA.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS group.圖2 α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑B-HT933對(duì)LPS刺激的心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響

3 B-HT933抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-αmRNA的表達(dá)，但不影響心肌細(xì)胞TLR4的mRNA表達(dá)

B-HT933并不影響LPS處理心肌細(xì)胞中TLR4 的mRNA表達(dá)，然而，LPS顯著上調(diào)心肌細(xì)胞TNF-α 的mRNA表達(dá); B-HT933能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α mRNA表達(dá)，見圖3。

4 B-HT933處理心肌細(xì)胞能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα和p38的磷酸化

如圖4所示，LPS處理心肌細(xì)胞30 min，心肌細(xì)胞IκBα和p38的磷酸化明顯增加，α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑B-HT933處理心肌細(xì)胞可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα磷酸化，但不能影響心肌細(xì)胞p38、JNK 和ERK的磷酸化。

討論

TNF-α作為一種重要的炎癥細(xì)胞因子參與心肌損傷的發(fā)生機(jī)制［11］。早期研究認(rèn)為，胎鼠心肌細(xì)胞上存在α2-腎上腺素能受體，該受體在胎鼠心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用，出生后心肌α2-腎上腺素能受體表達(dá)降低，成年鼠心肌細(xì)胞上幾乎沒有α2-腎上腺素能受體［9］。然而，新近的研究發(fā)現(xiàn)成年鼠心肌上也存在α2-腎上腺素能受體［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳鼠心肌細(xì)胞中存在α2-腎上腺素能受體，B-HT933能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表達(dá)和釋放TNF-α。

目前的研究已證實(shí)，心肌細(xì)胞上存在TLR4，LPS活化TLR4，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。根據(jù)接頭分子的不同，LPS/TLR4細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路包括MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路活化最終激活下游的IκB激酶(inhibitor of nuclear factor-κB kinase，IKK)和MAPK，從而導(dǎo)致IκBα磷酸化和NF-κB的活化，以及p38、JNK和ERK的磷酸化，最終啟動(dòng)TNF-α等靶基因的表達(dá)，介導(dǎo)心肌炎癥反應(yīng)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，B-HT933并不能影響LPS處理的心肌細(xì)胞表達(dá)TLR4，說明BHT933顯著抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表達(dá)和釋放TNF-α與心肌細(xì)胞TLR4的水平無關(guān)。研究表明，IκBα磷酸化導(dǎo)致NF-κB的活化以及p38的磷酸化在LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)TNF-α的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，抑制心肌細(xì)胞IκBα磷酸化或阻斷p38的磷酸化均能在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)［12-13］。因此，本研究進(jìn)一步觀察了α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)LPS誘導(dǎo)IκBα和p38磷酸化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS顯著增加心肌細(xì)胞IκBα和p38的磷酸化，而B-HT933明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα磷酸化。這些結(jié)果表明B-HT933可能通過抑制心肌細(xì)胞IκBα的磷酸化，從而阻斷LPS誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)。

Figure 3.The effects of B-HT933 (BHT)，a selective α2-adrenoceptor agonist，on TLR4 and TNF-α mRNA expression in LPS-challenged cardiomyocytes.The cardiomyocytes were cultured for 40 h and stimulated with BHT at concentration of 0.10 μmol/L or vehicle for 30 min，then with 0.10 μmol/L BHT plus 1.00 μmol/L LPS or 1.00 μmol/L LPS for another 1.5 h.The mRNA expression of TLR4 and TNF-α was detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS group.圖3 α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑B-HT933對(duì)LPS刺激的心肌細(xì)胞TLR4和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of B-HT933 (BHT)，a selective α2-adrenoceptor agonist，on IκBα，p38，JNK and ERK phosphorylation in LPS-challenged cardiomyocytes.The cardiomyocytes were cultured for 40 h and stimulated with BHT at concentration of 0.10 μmol/L or vehicle for 30 min，then with 0.10 μmol/L BHT plus 1.00 μmol/L LPS or 1.00 μmol/L LPS for another 30 min.The phosphorylation levels of IκBα，p38，JNK and ERK were determined by Western blotting.Mean±SEM.n=4～6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS group.圖4 α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑BHT對(duì)LPS刺激的心肌細(xì)胞IκBα、p38、JNK和ERK磷酸化的影響

新近，一些研究者發(fā)現(xiàn)成體大鼠心肌細(xì)胞上存在α2-腎上腺素能受體，激活α2-腎上腺素能受體可活化心肌磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt信號(hào)通路［10］。另一方面，激活PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α［14］。因此，B-HT933抑制LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α可能與PI3K/Akt信號(hào)通路的活化有關(guān)，這一推論是否正確，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)乳鼠心肌細(xì)胞上存在α2-腎上腺素能受體，α2-腎上腺素能受體活化可抑制LPS處理的心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，這一發(fā)現(xiàn)揭示了心肌細(xì)胞α2-腎上腺素能受體具有重要的病理生理作用，為探討心肌細(xì)胞α2-腎上腺素能受體在膿毒癥性心功能障礙發(fā)生機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，余小慧)

α2-adrenoceptor agonist B-HT933 suppresses LPS-induced TNF-α production in neonatal rat cardiomyocytes

ZHU Lin-xin1，YANG Duo-meng2，TANG Xiang-xu2，WANG Yuan2，LüXiu-xiu2，LI Hong-mei2，YAN Yu-xia3，QI Ren-bin2，LU Da-xiang2，WANG Hua-dong2
(1Grade 2011，Department of Clinical Medicine，2Department of Pathophysiology，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine of People’s Republic of China，3Department of Biochemistry，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: owanghd@jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of B-HT933，a selective α2-adrenoceptor agonist，on lipopolysaccharide (LPS) -induced TNF-α production in neonatal rat cardiomyocytes and to explore the underlying mechanisms.METHODS: The neonatal rat cardiomyocytes were cultured.The localization of α(2A)-adrenoceptor in the cardiomyocytes was examined by immunofluorescence staining.The cardiomyocytes were exposed to LPS or/and B-HT933 for different time.The level of TNF-α in the supernatants and the mRNA expression of TNF-α were detected by ELISA and real-time PCR，respectively.In addition，LPS-associated signal molecules in the cardiomyocytes were also examined by Western blotting.RESULTS: Immunofluorescence staining showed that α(2A)-adrenoceptors were localized in the cardiomyocytes.LPS stimulated TNF-α production in the cardiomyocytes in a dose and time-dependent manner.B-HT933 pretreatment significantly inhibited the expression of TNF-α at mRNA and protein levels in LPS-treated cardiomyocytes.Furthermore，LPS exposure induced IκBα and p38 phosphorylation in cardiomyocytes and only IκBα phosphorylation was prevented by BHT933 treatment.CONCLUSION:α(2A)-adrenoceptors are present in neonatal rat cardiomyocytes and its agonist B-HT933 inhibits LPS-induced TNF-α production in cardiomyocytes via suppressing IκBα phosphorylation.

［KEY WORDS］Neonatal rats; Cardiomyocytes; Lipopolysaccharides;α2-adrenoceptor

通訊作者△Tel: 020-85220241; E-mail: owanghd@jnu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170222; No.81372028) ;廣東省教育廳學(xué)科建設(shè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2013KJCX0019) ;廣州市科技計(jì)劃(No.12C22071599; No.201508020005)

［收稿日期］2015-06-06

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1595-06

［中圖分類號(hào)］R285.5; R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.011