秦　麗，關(guān)　莉，林銳珊，薛倩倩，徐進(jìn)文，閆福曼，李小英，劉海梅△(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，西醫(yī)基礎(chǔ)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州50006)

白藜蘆醇通過(guò)調(diào)節(jié)iNOS抑制C57BL/6J小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制探討*

秦麗1，關(guān)莉1，林銳珊2，薛倩倩1，徐進(jìn)文1，閆福曼1，李小英1，劉海梅1△
(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2西醫(yī)基礎(chǔ)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

［摘要］目的:探討白藜蘆醇(resveratrol，RES)對(duì)卵巢切除小鼠血脂四項(xiàng)總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及血清一氧化氮(nitric oxide，NO)含量、胸主動(dòng)脈的過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion，ONOO(－))及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白表達(dá)水平的影響。方法:雌性C57小鼠經(jīng)卵巢切除建立去勢(shì)模型后，分為假手術(shù)組、單純?nèi)?shì)組、假手術(shù)高脂組、模型高脂組和RES組。單純?nèi)?shì)組和假手術(shù)組給予普通飼料，其余給予高脂飼料。14周后，收集血清檢測(cè)各組血清的CHOL、TG、LDL-C和HDL-C水平，硝酸還原酶法測(cè)血漿NO水平，油紅O染色觀察動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)情況，DAB染色測(cè)定血管ONOO(－)及iNOS水平，免疫印跡測(cè)定血管組織的iNOS表達(dá)。結(jié)果:模型高脂組血清CHOL、TG、LDL-C和NO較正常對(duì)照組升高(P＜0.05) ;與模型高脂組相比，RES組可降低小鼠血清的TC、TG、LDL-C和NO(P＜0.05) ; 14周后，AS模型成功建立，模型高脂組有明顯的AS病理改變，單純?nèi)?shì)組無(wú)明顯AS斑塊，RES組AS病變明顯減輕;高脂喂養(yǎng)14周后，模型高脂組血管組織的iNOS及ONOO(–)表達(dá)也較正常對(duì)照組明顯提高(P＜0.05) ;與模型高脂組相比，RES組可降低小鼠胸主動(dòng)脈的iNOS表達(dá)(P＜0.05)，與此同時(shí)，血管ONOO(－)含量較模型高脂組降低。結(jié)論: RES可以抑制iNOS表達(dá)，減少NO生成，防治動(dòng)脈粥樣硬化。

［關(guān)鍵詞］白藜蘆醇;動(dòng)脈粥樣硬化;一氧化氮;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性疾病，外源性因素如低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高血壓、糖尿病、吸煙等引起的自由基增多，損害內(nèi)皮，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞黏附聚集、淋巴細(xì)胞激活等，在局部釋放血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和促凝因子等，誘發(fā)炎性反應(yīng)，并刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白合成增加，一氧化氮(nitric oxide，NO)分泌增多，進(jìn)一步加重AS。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇(resveratrol，RES)具有潛在的抗AS作用，但其機(jī)制尚不明確，本研究用C57BL/6J小鼠建立卵巢切除模型，試圖闡明白藜蘆醇、iNOS、NO和AS之間的關(guān)系。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6J小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為No.0004089。

2藥物、試劑和主要儀器

RES購(gòu)自Aladdin; iNOS抗體和nitrotyrosine抗體購(gòu)自Abcam; GAPDH抗體購(gòu)自Sigma; SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司; DAB顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋; NO試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

冰凍切片機(jī)(Leica) ; Olympus顯微鏡和ImageJ圖像分析軟件;冰凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司) ;酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

3方法

3.1分組和制備去勢(shì)模型60只雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)(sham)組、假手術(shù)高脂(high fat，HF)組(sham+ HF組)、卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)組、模型高脂(OVX+ HF)組和RES組。OVX組、OVX+ HF組和RES組均手術(shù)去勢(shì)，摘除雙側(cè)卵巢［1］。手術(shù)前禁食12 h，以10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰面固定，剔除下腹部長(zhǎng)毛，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)域，經(jīng)下腹部正中開(kāi)一切口約2 cm，依次切開(kāi)皮膚，皮下組織，腹白線等，找到子宮，之后沿著子宮末端找到卵巢，結(jié)扎后切除卵巢組織，并縫合皮下及皮膚層［2］。其余組進(jìn)行假手術(shù)操作，在切開(kāi)腹壁后找到輸卵管切除部分脂肪后縫合。

3.2分組和給藥腹腔術(shù)后正常飲食7 d后開(kāi)始給藥。RES組: 10只小鼠，以15 g/L的RES 0.2 mL/d灌胃，高脂飲食; sham組和OVX組:等容積的生理鹽水灌胃，普通飲食; OVX+ HF組和sham+ HF組:等容積的生理鹽水灌胃，高脂飲食。干預(yù)14周。

3.3血清的采集及血脂的測(cè)量實(shí)驗(yàn)14周末禁食12 h，摘眼球取血約0.5～1 mL，靜置后離心分離血清，生化分析儀檢測(cè)血脂4項(xiàng)總膽固醇CHOL、三酰甘油TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C。

3.4血漿中NO水平的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)14周末，采取眼球取血。將血樣本在3 000 r/min離心15 min，用硝酸還原酶法測(cè)定NO水平。

3.5胸主動(dòng)脈油紅染色實(shí)驗(yàn)14周末取血后小鼠頸椎脫臼法處死，立即取出胸主動(dòng)脈血管做常規(guī)冰凍切片，片厚10 μm，晾干存放在－80℃。用時(shí)各組取出1張切片，室溫晾干，配置好油紅工作液過(guò)濾，將配好的油紅滴加在組織上10 min，用濾紙吸干周邊的油紅，將切片放在60%的異丙醇中，待背景變無(wú)色后取出(顯微鏡下觀察)，稍微晾干，滴加蘇木素溶液(顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞核變藍(lán)色) 3 min，立即將切片置于自來(lái)水，流水洗10 min，取出切片甘油明膠封片，顯微鏡拍片。

3.6免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈iNOS的表達(dá)胸主動(dòng)脈經(jīng)常規(guī)固定、脫水、包埋，每例標(biāo)本均做厚度為10 μm的連續(xù)切片6～8張，進(jìn)行染色。iNOS的蛋白表達(dá)測(cè)定采用DAB染色，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。顯微鏡觀察并拍照，ImageJ進(jìn)行半定量分析。

3.7各組小鼠胸主動(dòng)脈ONOO－檢測(cè)冰凍切片進(jìn)行DAB染色，使用nitrotyrosine抗體，過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。顯微鏡觀察并拍照，ImageJ進(jìn)行半定量分析。

3.8Western blot檢測(cè)iNOS蛋白的表達(dá)RIPA法提取組織蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，用10% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后與iNOS和GAPDH相應(yīng)抗體4℃孵育過(guò)夜，次日以TBST洗膜，再用相應(yīng)的II抗(羊抗兔)室溫孵育1 h，洗膜后加化學(xué)發(fā)光劑暗室中曝光，膠片經(jīng)顯影和定影，蛋白帶用凝膠圖像分析儀分析和定量。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組小鼠血脂水平的比較

各組小鼠之間的CHOL、HDL和LDL水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; OVX+ HF組除HDL-C較正常組降低外，CHOL、TG和LDL-C均較正常對(duì)照組升高(P＜0.05) ;與OVX+ HF組相比，RES預(yù)處理后可明顯降低小鼠血清的CHOL、TG和LDL-C，升高HDL-C(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠血脂水平的比較Table 1.The levels of blood lipids in different groups (mmol/L.Mean±SD.n=6)

2各組小鼠血漿中的NO水平

高脂喂養(yǎng)14周后，OVX+ HF組血清NO含量較sham組明顯升高(P＜0.05)，與OVX+ HF組相比，RES可有效降低血清的NO含量(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of resveratrol on plasma NO content in different groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖1白藜蘆醇對(duì)C57卵巢去勢(shì)小鼠血漿NO水平的影響

3各組油紅染色觀察

高脂喂養(yǎng)14周后，sham組血管結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，內(nèi)膜連續(xù)完整而光滑; OVX+ HF組的內(nèi)膜有較明顯的脂質(zhì)斑塊，內(nèi)膜明顯增厚; RES組內(nèi)膜增厚程度均較輕，脂質(zhì)斑塊也明顯減少。半定量分析后可見(jiàn)RES組平均光密度值較OVX+ HF組明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示RES對(duì)小鼠的AS斑塊的形成有抑制作用。

4各組iNOS免疫組化染色觀察

高脂喂養(yǎng)14周后，胸主動(dòng)脈切片進(jìn)行DAB染色，結(jié)果顯示OVX+ HF組的iNOS表達(dá)相比sham組顯著增加，而RES組的iNOS表達(dá)量明顯低于OVX+ HF組。半定量分析結(jié)果顯示OVX+ HF組的平均吸光度顯著高于其它組，而RES組的平均吸光度則明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖3，說(shuō)明RES能有效抑制血管內(nèi)皮iNOS的表達(dá)，從而降低NO的生成。

Figure 2.The structure and average absorbance of the aorta in C57BL/6J mice with Oil Red O staining (×20).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖2油紅染色顯示C57BL/6J小鼠胸主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和油紅染色的半定量分析

Figure 3.The effect of resveratrol on expression of iNOS in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖3免疫組織化學(xué)染色分析主動(dòng)脈iNOS的表達(dá)

5胸主動(dòng)脈ONOO－的檢測(cè)

DAB染色圖像顯示OVX+ HF組的ONOO－含量顯著高于其它組，而RES組的ONOO－含量則較之大幅度減少。半定量分析顯示OVX+ HF組組的平均吸光度明顯高于其它組，而RES組的平均吸光度只有OVX+ HF組的1/2左右(P＜0.05)，見(jiàn)圖4，證明RES能有效地減少ONOO－。

Figure 4.The ONOO－production in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖4血管ONOO－的DAB染色和半定量分析

6各組小鼠血管的iNOS表達(dá)

與對(duì)照組相比，OVX+ HF組的iNOS蛋白表達(dá)明顯增高，而RES灌胃后，可明顯降低iNOS在血管組織中的表達(dá)(P＜0.05)，提示RES能有效抑制iNOS在血管組織中的表達(dá)，從而降低NO的合成，見(jiàn)圖5。

討論

AS是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)［3-4］。大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明，AS的危險(xiǎn)因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖(糖尿病)、高纖維蛋白原血癥，肥胖、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活化、吸煙，NO等自體生物活性物質(zhì)代謝紊亂等因素［5-6］。到目前為止，AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，存在多種學(xué)說(shuō)，涉及多種危險(xiǎn)因素［7］。

Figure 5.The effect of resveratrol on the protein expression of iNOS in the thoracic aorta of different groups.Mean± SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖5 Western blot檢測(cè)C57小鼠胸主動(dòng)脈的iNOS表達(dá)

AS發(fā)生、發(fā)展中，高脂血癥所造成的動(dòng)脈內(nèi)皮功能損害起關(guān)鍵作用，這種損害可能的原因是內(nèi)皮細(xì)胞NO代謝的異常。NO廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，是一種重要的生物活性分子。NOS能夠催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸和NO，現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)的NOS類(lèi)型包括神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、iNOS和內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)。在動(dòng)脈血管壁組織中與AS相關(guān)聯(lián)的主要是eNOS和iNOS。在正常生理狀態(tài)下，NO是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的eNOS催化產(chǎn)生的，血管中缺乏iNOS。但在某些炎癥介質(zhì)的刺激下，血管中的iNOS可能被誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生大量的超出生理濃度的NO，這些過(guò)量的NO可能反而引起血管功能障礙，對(duì)機(jī)體造成損害［8］。因此，NO 在AS的發(fā)病中具有雙重作用［9］。大量NO與氧自由基可迅速反應(yīng)生成氧化活性更高的ONOO－，比NO對(duì)細(xì)胞具有更大的損傷性［10］，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組有明顯的高脂血癥，iNOS表達(dá)顯著升高，產(chǎn)生大量的NO，有明顯的斑塊形成。

RES是一類(lèi)目前尚未發(fā)現(xiàn)毒副作用的植物雌激素，作用類(lèi)似于雌激素，但更有優(yōu)勢(shì)及其潛力，主要存在于虎杖、藜蘆、葡萄等植物中，具有一定的抗AS作用［11］。已有相關(guān)研究顯示RES可明顯降低高脂飲食大鼠血清的LDL、甘油三酯、膽固醇含量，降低動(dòng)脈硬化指數(shù)［12］。邊寧等［13］報(bào)道高脂對(duì)照組大鼠血清iNOS表達(dá)顯著增加，產(chǎn)生大量NO，給予RES大鼠血清iNOS表達(dá)明顯減少，血脂顯著降低，說(shuō)明RES可糾正高脂血癥大鼠NO代謝紊亂，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)抗AS的發(fā)生和發(fā)展。也有報(bào)道RES具有酚羥基結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的自由基清除能力［14］。Olas等［15］研究顯示RES可明顯抑制高濃度的ONOO－血漿介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明白藜蘆醇組ONOO－生成明顯降低，NO含量減少，也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］梁秀蘭.SD大鼠絕經(jīng)模型的建立［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(9) : 1414-1416.

［2］王燁，徐蓮薇，朱芝玲.調(diào)更湯對(duì)圍絕經(jīng)期雌性大鼠生殖內(nèi)分泌影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2014，48(12) : 72-74.

［3］Cai X，Li X，Li L，et al.Adiponectin reduces carotid atherosclerotic plaque formation in ApoE－/－mice: roles of oxidative and nitrosative stress and inducible nitric oxide synthase［J］.Mol Med Rep，2015，11 (3) : 1715-1721.

［4］O’Neal WT，Soliman EZ，Qureshi W，et al.Sustained pre-hypertensive blood pressure and incident atrial fibrillation: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis［J］.J Am Soc Hypertens，2015，9(3) : 191-196.

［5］Obuchowicz A，Kniazewska M，Zmudzińska-Kitczak J，et al.Concentrations of tumour necrosis factor-α and its soluble receptors in the serum of teenagers with atherosclerosis risk factors: obesity or obesity combined with hypertension［J］.J Pediatr Endocrinol Metab，2014，27(11-12) : 1209-1212.

［6］Wand CJ，Liu JT，Guo F，et al.Endothelin-1 induces the expression of C-reactive protein in vascular smooth muscle cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，389 (3) : 537-542.

［7］劉俊田.動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(2) : 142-145.

［8］Zhang X，Xiong H，LI H，et al.Effects of florlenicol on LPS-induced nitric oxide and prostaglandin E2production in RAW 264.7 macrophages［J］.Fundam Clin Pharmacol，2011，25(5) : 591-598.

［9］Li H，Horke S，F(xiàn)?rstermann U.Vascular oxidative stress，nitric oxide and atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2014，237(1) : 208-219.

［10］劉艷，吳偉康，楊成梯，等.從氧自由基、一氧化氮探討四逆湯抗急性失血性休克的肝臟機(jī)制［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(6) : 810-814.

［11］He S，Yan X.From resveratrol to its derivatives: new sources of nature antioxidant［J］.Curr Med Chem，2013，20(8) : 1005-1017.

［12］趙克森.白藜蘆醇的生物學(xué)效應(yīng)和特性［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(9) : 1709-1711.

［13］邊寧，龔博君，郭軍，等.一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(3) : 414-418.

［14］過(guò)華蕾，廖麗貞，陳燕玲，等.白藜蘆醇對(duì)抗D-半乳糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老及其機(jī)制［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(12) : 2141-2146.

［15］Olas B，Nowak P，Kolodziejczyk J，et al.Protective effects of resveratrol against oxidative/nitrative modifications of plasm proteins and lipids exposed to peroxynitrite ［J］.J Nutr Biochem，2006，17(2) : 96-102.

(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Resveratrol regulates iNOS to inhibit atherosclerosis in C57BL/6J mice

QIN Li1，GUAN Li1，LIN Rui-shan2，XUE Qian-qian1，XU Jin-wen1，YAN Fu-man1，LI Xiao-ying1，LIU Hai-mei1
(1Department of Physiology，2Western Medicine Basis Public Laboratory，Basic Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China.E-mail: lhmei99@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of resveratrol on the lipids (CHOL，TG，LDL-C and HDL-C)，nitric oxide (NO)，peroxynitrite anion (ONOO(－)) and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the artery of the mice with ovariotomy (OVX).METHODS: The lipid levels and NO level in the serum were measured.The changes of atherosclerosis were evaluated with Oil Red O staining.The expression of iNOS was measured by DAB staining and Western blot.The ONOO(－)production was measured by DAB staining.RESULTS: Compared with sham group，the levels of the lipids and NO production in OVX+ high fat (HF) group were increased (P＜0.05).Compared with OVX+ HF group，the levels of the lipids and NO production in resveratrol group were decreased (P＜0.05).Fourteen weeks later，the atherosclerosis model was successfully established.Compared with OVX+ HF group，the iNOS expression and the ONOO(－)production in resveratrol group were decreased (P＜0.05)，while those in sham group were increased (P＜0.05).CONCLUSION: Resveratrol prevents and treats atherosclerosis by inhibiting the iNOS expression in C57BL/6J mice.

［KEY WORDS］Resveratrol; Atherosclerosis; Nitric oxide; Inducible nitric oxide synthase

通訊作者△Tel: 020-39358028; E-mail: lhmei99@163.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202186)

［收稿日期］2015-04-02［修回日期］2015-08-02

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1601-05

［中圖分類(lèi)號(hào)］R363.1; R543

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.012