活性炭固相萃取/膠束電動色譜聯(lián)用技術(shù)用于雷公藤3種有效成分的測定

蔣銀燕，郭麗娟，崔小瑩,王翠瓊，胡小建，李建明

(1.長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219；2.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013)

活性炭固相萃取/膠束電動色譜聯(lián)用技術(shù)用于雷公藤3種有效成分的測定

蔣銀燕1，郭麗娟1，崔小瑩1,王翠瓊1，胡小建1，李建明2*

(1.長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219；2.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013)

建立了活性炭固相萃取/膠束電動色譜法同時測定中藥雷公藤中的雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚內(nèi)酯的方法。優(yōu)化了萃取pH值、乙醇洗脫體積、電泳運行緩沖溶液pH值與濃度、膠束SDS的濃度及進樣時間、電壓等條件。進行電泳分離之前，分析物用活性炭進行吸附后用2.0 mL乙醇洗脫。在214 nm 波長處，分離電壓20 kV，20 mmol/L硼酸-10 mmol/L硼砂(pH 8.0)-20 mmol/L SDS運行緩沖溶液條件下，3種成分在8 min內(nèi)得到完全分離，雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮在4.0×10-5～4.0×10-3mol/L，雷酚內(nèi)酯在4.0×10-5～1.0×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回收率為81.0%～102.9%，方法的檢出限分別為1.42×10-6，7.90×10-7，2.96×10-7mol/L，相對標準偏差(RSD )分別為 3.2%，5.4%，3.5%。所建立的方法簡單、快速、準確，成功用于雷公藤片樣品的測定。

雷公藤甲素；雷公藤內(nèi)酯酮；雷酚內(nèi)酯；固相萃??；膠束電動色譜

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬木制藤本植物，作為殺蟲劑使用已有近2 000年的歷史。近年發(fā)現(xiàn)該藥有抗炎和抑制免疫的功效，目前已用于人體免疫系統(tǒng)疾病的治療，包括：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊髓炎、兒童原發(fā)性和繼發(fā)性腎病綜合癥、成人各型腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎和銀屑病等多種皮膚病[1-3]。雷公藤及其提取物的成分很復(fù)雜，早在1972年，Kupchan就試圖分離提取雷公藤中的有效成分。國內(nèi)外學(xué)者認為雷公藤紅素(Tripterine)、雷公藤內(nèi)酯酮(Triptonide)、雷公藤甲素(又名雷公藤內(nèi)酯醇，Triptolide)和雷公藤乙素(Tripdiolide)是雷公藤的主要活性成分[4]。

目前測定中藥中有效成分的常用方法有氣相色譜法(GC)[5-6]、固定化脂質(zhì)體色譜(ILC)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-9]及毛細管電泳法(CE)[10-11]等。毛細管電泳作為一種新興的高效分析技術(shù)，在中藥鑒定分析方面以其高效快速、樣品用量少、操作簡便等優(yōu)點得到廣泛使用，但由于毛細管進樣體積小(進樣量小于毛細管長度的1%)以及柱上檢測的光程短,通用型的紫外檢測器雖然能達到很低的質(zhì)量檢出限,但樣品的濃度檢出限仍很高(比HPLC高幾個數(shù)量級)[12-13]，這使CE在實際樣品痕量組分的分離分析中受到很大限制。因此，在使用CE進行定量分析測定時需對樣品富集后再檢測，以提高其檢測靈敏度，同時消除基體干擾。據(jù)報道，與毛細管電泳法聯(lián)用的樣品預(yù)富集方法主要有液液萃取(LLE)[14]、固相萃取(SPE)[15-16]以及濁點萃取[17]等。但尚未見采用活性炭萃取富集后用膠束電動色譜技術(shù)來分離測定雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤甲素及雷酚內(nèi)酯的報道。本文利用膠束電動色譜的高效、快速、運行成本低等特點，聯(lián)用活性炭固相萃取技術(shù)，建立了一種能夠同時檢測雷公藤中上述3種有效活性成分(結(jié)構(gòu)式見圖1)的分析方法。

圖1 3種雷公藤有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細管電泳儀帶紫外檢測器(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)；未涂敷熔融石英毛細管(75 μm I.D.×375 μm O.D.，柱長51 cm，有效長度43 cm，河北永年科技有限公司)。

雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯(色譜純，福建醫(yī)藥廠)，雷公藤片(三金制藥廠，湖北黃石，雷公藤甲素標識含量為33 μg/片)。實驗所用其他試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。所有溶液均使用0.22 μm纖維膜過濾且超聲3 min。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標準溶液的配制 分別精密稱取一定量的雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤甲素和雷酚內(nèi)酯標準品，溶于甲醇中，配成濃度為4.0×10-3mol/L的儲備液。實驗時，工作溶液由儲備液用甲醇稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品溶液的配制 精確稱取雷公藤片一片置于離心管中，用1 mL甲醇浸泡24 h，再將混合物超聲30 min后，以3 500 r·min-1離心20 min。上層液體用0.22 μm的微孔濾膜過濾，所得清液用乙醇定容至2.0 mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 活性炭固相萃取 在10 mL離心管中加入10 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(pH 6.5)，再移取一定量樣品溶液至離心管中，加入30 mg活性炭后隨即超聲15 min，再以3 500 r/min離心5 min，棄去上層液體，固相中加入2 mL乙醇，超聲洗脫后，離心5 min，用注射器將管中液體吸取出來，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至小試劑瓶中待用。

1.3.2 MEKC分離條件 實驗前，毛細管依次用1 mol/L NaOH、無水乙醇、水、運行緩沖液沖洗2 min，以保證實驗的重現(xiàn)性。實驗所用溶液進樣前均用0.22 μm的濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣約3 min。運行緩沖溶液：20 mmol/L硼酸-10 mmol/L硼砂-20 mmol/L SDS緩沖溶液(pH 8.0)，檢測波長214 nm，分離電壓20 kV，高度進樣，進樣高度約9 cm，進樣時間5 s，為確保重復(fù)性，每個樣品至少平行測定3次。

圖2 pH值對萃取率的影響

圖3 緩沖溶液pH值對電泳遷移時間的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭固相萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 pH值的影響 萃取體系的pH值是影響固相萃取效率的重要因素，pH值可以改變目標物/吸附劑的離子化或質(zhì)子化程度。為了考察不同pH值的磷酸緩沖液對萃取率的影響，本實驗研究了pH值在4.0～8.0范圍內(nèi)變化時對萃取率的影響情況，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見，pH 6.5時3種化合物的萃取率均較高，萃取率可達90%以上。

2.1.2 超聲洗脫時間的影響 超聲洗脫時間對萃取率有一定的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，萃取率隨時間的增加而增加，但當洗脫時間超過15 min后，3種有效成分的萃取效率隨時間增加出現(xiàn)緩慢降低現(xiàn)象。綜合考慮，本實驗選擇最佳超聲洗脫時間為15 min。

2.1.3 乙醇洗脫體積的影響 考察了乙醇洗脫體積對萃取率的影響，分別加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL乙醇后超聲15 min，以3 500 r/min離心5 min。取出離心管，吸取出溶液，通過0.22 μm的微孔濾膜過濾后，進行CE測定。結(jié)果顯示，最初萃取率隨著洗脫溶液體積的增加而增大，當用2.0 mL乙醇洗脫時，3類成分的萃取效率均可達到90%以上，繼續(xù)增大洗脫溶液體積，則萃取效率反而有所降低。因此，本實驗選擇乙醇的最佳洗脫體積為2.0 mL。

2.2 MEKC條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液pH值的影響 緩沖溶液的pH值直接影響毛細管的表面電勢，從而影響電滲流的速度，同時溶液的pH值也決定樣品中各組分分子的解離程度，從而影響組分的遷移時間和分離度。實驗發(fā)現(xiàn)pH值在7.0～10.0范圍內(nèi)能實現(xiàn)3種成分的有效分離，在該范圍內(nèi)，分離時間隨pH值的變化結(jié)果如圖3所示。當pH值小于8.0時，由于電滲流隨著pH值的增加而增大，因此各分析物的出峰時間也隨之縮短。緩沖液的pH值大于8.0后，各分析物的出峰時間反而延長。因此，實驗選用pH值為8.0的緩沖體系。

2.2.2 緩沖溶液種類及濃度的影響 緩沖溶液種類及濃度對膠束電動色譜分離效果有明顯的影響。在pH 8.0條件下，研究了不同種類的緩沖溶液對分離效果的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，硼砂-硼酸緩沖體系中3種成分的分離效果明顯，靈敏度較高。另一方面，緩沖溶液濃度決定了溶液的粘度、擴散系數(shù)及毛細管內(nèi)壁的電滲流，是影響分離度的重要因素。對不同濃度的緩沖溶液(硼酸濃度：10～40 mmol/L，硼砂濃度：5～25 mmol/L)進行考察后發(fā)現(xiàn)，分離度和遷移時間均隨緩沖液濃度的增加而增加，且高濃度的緩沖液會使毛細管內(nèi)壁產(chǎn)生過高的焦耳熱，從而使管內(nèi)產(chǎn)生氣泡，或者使基線不穩(wěn)定，甚至干擾分離。3種成分在20 mmol/L硼酸-10 mmol/L硼砂緩沖液中運行時可得到較為理想的峰形。

圖4 SDS濃度對遷移時間的影響

2.2.3 SDS濃度對分離的影響 考察了SDS濃度在5～50 mmol/L變化時對電泳分離的影響。如圖4所示，由于膠束的交聯(lián)作用，分離度以及分離時間均隨SDS濃度的增加而增加，但當SDS濃度低于10 mmol/L時,溶劑和內(nèi)酯醇的峰無法分離,且雷酚內(nèi)酯不出峰；當SDS濃度低于20 mmol/L時,出現(xiàn)雙峰。綜合考慮分離度和分析時間，本實驗選用SDS的最佳濃度為20 mmol/L。

2.2.4 進樣時間及分離電壓的影響 考察了進樣時間在3～10 s范圍內(nèi)變化時對峰形以及峰面積的影響。實驗結(jié)果表明，在3～5 s內(nèi)，隨著進樣時間的增長，進樣量增大，峰面積呈線性增大，但分離度變化不大；而在5～10 s內(nèi)，進樣時間越長，進樣量越大，峰面積越大，但分離度減小，色譜峰展寬。為了獲得最佳分離效果，最終選擇5 s作為理想的進樣時間。

溶質(zhì)遷移時間、柱效和分離度均可從升高外加電壓而獲益。實驗結(jié)果表明：隨著電壓的增大，分離時間呈線性減小，但當電壓增至20 kV時，遷移時間開始偏離線性，峰形重合，分離度減小。這是由于在高電壓下，產(chǎn)生的焦耳熱增多，在不能有效地驅(qū)散所產(chǎn)生的焦耳熱的情況下，柱溫顯著升高，導(dǎo)致緩沖溶液的電導(dǎo)增加，電流增大，粘度減小，雙電層增厚，且毛細管內(nèi)徑形成徑向溫度梯度，導(dǎo)致區(qū)帶增寬，所以本實驗選擇最佳分離電壓為20 kV。

圖5 3種雷公藤成分的標樣電泳圖

2.3 線性范圍、檢出限與精密度

分別用SPE/MEKC聯(lián)用方法和MEKC法測定3種相同濃度的雷公藤成分，電泳圖如圖5所示。比較所得的電泳圖可以看出，相同濃度的3種雷公藤成分經(jīng)固相萃取后，峰面積均有明顯增加，富集倍數(shù)為5倍，說明固相萃取法具有顯著的富集效果。在優(yōu)化實驗條件下，3種成分在8 min內(nèi)得到完全分離。將濃度均為5.0×10-4mol/L的3種成分的混合標準溶液連續(xù)進樣3次，峰面積的相對標準偏差(RSD)為2.5%～5.5%，結(jié)果表明此方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。以標準溶液濃度對相應(yīng)峰面積繪制標準曲線，得到3種化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(3倍信噪比,S/N=3)見表1。從表1中可以看出，雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮在4.0×10-5～4.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，雷酚內(nèi)酯在4.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的檢出限為2.96×10-7～1.42×10-6mol/L，峰面積的相對標準偏差(RSD,n=6 )均小于5.5%,方法顯示了良好的精密度。

表1 3種有效成分的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

圖6 雷公藤片樣品(a)及加標樣品(b)的電泳圖

2.4 實際樣品的測定

雷公藤片樣品溶液經(jīng)“1.2.2”方法處理后，用所建立的方法進行其3種有效成分含量的測定，并進行加標回收實驗。結(jié)果顯示，在優(yōu)化的分離和檢測條件下，基本能夠消除雷公藤片中基體雜質(zhì)對分離檢測的干擾，雷公藤片樣品溶液中所含雷公藤甲素為3.95×10-5mol·L-1(即28.5 μg/片，與標示值33 μg/片接近)，不含雷公藤內(nèi)酯酮及雷酚內(nèi)酯成分(圖6)。加標測定后，3種雷公藤成分的加標回收率為81.0%～102.9%(見表2)，基本滿足分析方法的要求。

表2 實際樣品的測定結(jié)果及加標回收率

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3 結(jié) 論

本文采用活性炭固相萃取/膠束電動色譜聯(lián)用技術(shù)，建立了中藥雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚內(nèi)酯的分離測定方法，檢出限為2.96×10-7～1.42×10-6mol/L。用活性炭作為固相萃取介質(zhì)，建立的SPE/MEKC聯(lián)用方法操作簡單，且進樣量小、分析時間短、試劑消耗少、環(huán)保，為中藥雷公藤提取物的分離檢測提供了快速、高效、準確的分析方法。將該方法用于雷公藤片樣品的測定，結(jié)果較為滿意。

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Determination of Three Active Components in Tripterygium Wilfordii Hook F.by Activated Carbon Solid Phase Extraction Combined with Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography

JIANG Yin-yan1，GUO Li-juan1，CUI Xiao-ying1，WANG Cui-qiong1，HU Xiao-jian1，LI Jian-ming2*

(1.Department of Basic Medicine,Changsha Medicial University,Changsha 410219,China;2.Xiangya School of Medicine,Central South University,Changsha 410013,China)

A method has been developed for simultaneous determination of triptolide,triptonide and triptophenolide in traditional Chinese herb Tripterygium wilfordii Hook F.by micellar electrokinetic capillary chromatography(MEKC) combined with activated carbon solid phase extraction.Effects of some important factors,such as pH value of extraction,eluant volume of ethanol，pH value and concentration of running buffer,concentration of sodium dodecyl sulfate(SDS)，separation voltage and injection time were investigated.The analytes were extracted with activated carbon in phosphate buffer solution(pH 6.5),then eluted with 2.0 mL ethanol before separated by MEKC.At 214 nm wavelength,the detection analytes could be well separated within 8 min at separation voltage of 20 kV in 20 mmol/L boric acid-10 mmol/L borax(pH 8.0)-20 mmol/L SDS.Under the optimized conditions,the calibration curves were linear in the range of 4.0×10-5-4.0×10-3mol/L for triptolide and the triptonide,and 4.0×10-5-1.0×10-3mol/L for triptophenolide.The detection limits of triptolide,triptonide and triptophenolide were 1.42×10-6,7.90×10-7,2.96×10-7mol/L,respectively,and the relative standard deviations(RSDs,n=6) for peak areas were 3.2%,5.4%,3.5%,respectively.The proposed method had the advatages of simplicity,rapidness,low sample consumption and accuracy,and was successfully applied in the determination of the analytes in Tripterygium wilfordii tablet with recoveroes of 81.0%-102.9%.

triptolide；triptonide；triptophenolide;solid phase extraction(SPE);micellar electro-kinetic capillary chromatography(MEKC)

2014-09-30；

2014-10-25

湖南省科技廳科技計劃項目(2014SK3025)；湖南省教育廳科學(xué)研究項目(12C0489,12B018,13C1125 )；長沙市科技計劃項目(K1207042-31)

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.011

O657.7；TQ460.72

A

1004-4957(2015)02-0189-05

*通訊作者：李建明，在讀博士，副教授，研究方向：神經(jīng)生物學(xué),Tel:0731-88498021，E-mail:jyyhello@126.com