孟慶君　高原　呂娜

摘 要：糞腸球菌與多種感染相關(guān)，明膠酶是其主要毒力因子之一，它影響糞腸球菌毒力，與糞腸球菌生物被膜形成有關(guān)?，F(xiàn)對(duì)gelE在生物被膜形成中的作用進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌；明膠酶；生物被膜

中圖分類號(hào)：S85 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號(hào)：2014-0542

Abstract： Enterococcus faecalis associated with a variety of infections， gelatinase is one of the major virulence factor， it affects Enterococcus faecalis virulence， and Enterococcus faecalis biofilm formation. Now the author reviewed the gelE role in biofilm formation.

Key words： Enterococcus faecalis； Gelatinase； Biofilm

0 引言

腸球菌早已被確認(rèn)為條件性致病菌，經(jīng)常參與傷口感染、腹腔內(nèi)膿腫以及泌尿道、膽道、根管感染，主要見于免疫力低下或過量使用抗生素的患者[1]，也可以導(dǎo)致敗血癥、心內(nèi)膜炎等從而危及生命，死亡率達(dá)21.0%～27.5%[2]。在過去的幾十年中，腸球菌已成為越來越嚴(yán)重的醫(yī)院病原體，部分原因是它普遍的多重抗生素耐藥性[3]。除了溶細(xì)胞素，其本身對(duì)廣泛的原核和真核細(xì)胞是致命的，在糞腸球菌中已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)毒力相關(guān)因子，包括聚集物質(zhì)（Agg）、腸球菌表面蛋白（Esp）以及2個(gè)胞外蛋白酶：明膠酶（gelatinase，gelE）和絲氨酸蛋白酶（sprE）[4]。這些因子之間協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)菌寄居、遷移和生物被膜的形成，從而增強(qiáng)其毒力。在特定條件下細(xì)菌能夠形成生物被膜，從而增強(qiáng)對(duì)抗生素和宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力，引起感染性疾病。生物被膜形成機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)密度感應(yīng)系統(tǒng)（QS）的調(diào)控有重要作用，gelE基因作為腸球菌主要QS系統(tǒng)之一的fsr系統(tǒng)調(diào)控的下游基因，其編碼的蛋白（gelE）與糞腸球菌生物被膜形成的關(guān)系亦受到重視[5]。gelE和sprE編碼在同一個(gè)操縱子上，gelE-sprE，其表達(dá)由fsr位點(diǎn)編碼的密度感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[6]。文章對(duì)糞腸球菌主要毒力因子gelE，及其在生物膜形成過程中的作用進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌生物被膜

細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等，將其自身包裹其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物，主要由細(xì)菌、高水化的多陰離子基質(zhì)及被俘獲的體外的大分子組成。生物被膜是細(xì)菌的一種具有保護(hù)性的生長模式，具有結(jié)構(gòu)和代謝復(fù)雜性。在特定的條件下，細(xì)菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的細(xì)菌稱為被膜菌。被膜菌無論其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性、致病性還是對(duì)環(huán)境因子的敏感性等都與浮游細(xì)菌有顯著的不同，尤其對(duì)抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的抵抗力，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復(fù)發(fā)作。細(xì)菌生物被膜粘附在各種醫(yī)療器械及導(dǎo)管上極難清除，以至引發(fā)大量的醫(yī)源性感染。

細(xì)菌生物被膜的致病特點(diǎn)包括病灶局部的炎癥反應(yīng)不很強(qiáng)烈，感染有相互轉(zhuǎn)化的靜止期和發(fā)作期；抗菌藥物治療起初可能有效，但以后治療常常失敗；致病菌主要是來自皮膚和周圍環(huán)境中的致病菌如金黃色葡萄球菌，糞腸球菌等。

2 生物被膜形成

生物被膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，其形成過程可分為3個(gè)階段：初始粘附階段、聚集階段和生物被膜成熟階段。其中初始粘附是生物被膜形成的第1階段，細(xì)菌最終能否粘附于表面取決于細(xì)菌與粘附表面接觸面積足夠大和兩接觸面之間所產(chǎn)生的吸附力大于排斥力。細(xì)菌粘附主要是通過細(xì)菌表面特定的粘素蛋白識(shí)別宿主表面受體來完成，具有特異性和選擇性。接觸表面的蛋白、糖蛋白和糖脂可作為受體，選擇性地吸附特定種類的細(xì)菌。細(xì)菌粘附可分為可逆粘附和不可逆粘附2個(gè)階段，在可逆附著階段影響其附著作用力較弱，主要為范德華力、靜電力、疏水作用等；在不可逆附著階段，細(xì)胞通過它的運(yùn)輸器官和附屬肢體如鞭毛、纖毛和胞外多聚糖纖維等來達(dá)到接觸表面。細(xì)菌粘附于表面后即調(diào)整基因表達(dá)，在生長繁殖的同時(shí)分泌大量的胞外多聚糖（exopolysaccharide，EPS），包裹、粘附細(xì)胞逐漸形成微生物群落。細(xì)菌外多聚基質(zhì)包裹是生物被膜成熟階段。表面固生細(xì)菌包裹與其自身分泌的多聚糖基質(zhì)中，形成了高度有組織的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有不均質(zhì)性，且在其中分布有可供運(yùn)送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物的通道。

3 明膠酶在生物被膜形成中的作用

3.1 明膠酶（gelE）

明膠酶基因gelE是糞腸球菌分泌的一種Zn金屬蛋白酶，是流行病學(xué)資料和動(dòng)物模型研究中的1個(gè)致病因素。位于腸球菌染色體上，是一個(gè)28 ku或32 ku的細(xì)胞外鋅肽鏈內(nèi)切酶（第二金屬內(nèi)肽酶；微生物蛋白酶），長度約1530個(gè)堿基[7]，分子量約為31500，最適pH大概為6～8，等電點(diǎn)為4.6。其上游是糞腸球菌調(diào)節(jié)器fsr基因和3個(gè)啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控明膠酶基因的表達(dá)；下游是絲氨酸蛋白酶基因sprE，由855個(gè)堿基組成，與腸球菌損傷宿主組織有關(guān)[8]。明膠酶底物特異性的研究已經(jīng)表明，它與疏水性和不溶性膠原相互作用。動(dòng)物模型證實(shí)明膠酶及其調(diào)節(jié)基因fsr介導(dǎo)菌株的毒力作用，參與炎癥進(jìn)程，與腸球菌向感染灶周圍擴(kuò)散有關(guān)。R. Creti[9]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50%臨床分離菌株表達(dá)gelE，健康人分離株僅27%陽性。在含30 g/L的明膠或15 g/L的脫脂乳的半固體培養(yǎng)基上，蛋白酶產(chǎn)物很容易檢測到。C M Waters[10]等利用fsr密度感應(yīng)系統(tǒng)在高細(xì)胞密度條件下誘導(dǎo)表達(dá)gelE，gelE被證明是負(fù)責(zé)一些不穩(wěn)定的Asc10（聚集物質(zhì)）突變體的蛋白質(zhì)，這意味著gelE的功能是清除細(xì)菌細(xì)胞表面錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的雙球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)鏈?zhǔn)菑?～10個(gè)細(xì)胞，而破壞gelE生產(chǎn)會(huì)導(dǎo)致糞腸桿菌細(xì)胞鏈增長。在化膿性鏈球菌表達(dá)蛋白時(shí)，gelE的這一功能也顯示出來。糞腸桿菌gelE表達(dá)時(shí)菌株更易自溶，這表明gelE影響細(xì)胞鏈的長度是通過激活自溶素。gelE也是聚合纖維蛋白降解的必要物質(zhì)。gelE表達(dá)降低cCF10滴度，肽信息素誘導(dǎo)pCF10共軛，且增加了pCF10共軛到非gelE表達(dá)株中。gelE的這些功能表明它的作用是在高密度的環(huán)境中增加糞腸球菌的傳播。

3.2 gelE縮短糞腸球菌鏈

根據(jù)C M Waters等[10]試驗(yàn)，使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定菌株的向散射光。每個(gè)菌株向散射光平均值的大小證實(shí)了gelE表達(dá)株和gelE突變株之間的差異是顯著的，并且可在大范圍內(nèi)觀察到。gelE表達(dá)載體pMSP3614電穿孔進(jìn)入化膿性鏈球菌90-226，來測定gelE對(duì)糞腸球菌鏈長度的縮短能力是否是特效的。誘導(dǎo)gelE在90-226表達(dá)導(dǎo)致鏈長度減少，但對(duì)雙球菌單細(xì)胞并不是完全的。這表明，糞腸球菌gelE介導(dǎo)的鏈長度縮短的機(jī)制可能保存在化膿性鏈球菌90-226菌株中。

3.3 gelE增加糞腸球菌自溶

糞腸球菌有兩個(gè)獨(dú)特的自溶素，一個(gè)是針對(duì)其自身細(xì)胞壁（胞壁質(zhì)酶-1）有活性，另一個(gè)是針對(duì)溶壁微球菌細(xì)胞壁（胞壁質(zhì)酶-2）有活性。在對(duì)溶菌酶-1自溶素的初始特性描述中發(fā)現(xiàn)，腸球菌（糞腸球菌）液化亞種31號(hào)菌株的鋅金屬蛋白酶（gelE）是通過激活溶菌酶-1活性來加速糞腸球菌細(xì)胞壁裂解的。并且，蛋白酶抑制因子抑制胞壁質(zhì)酶-1由130-kDa休眠形式轉(zhuǎn)換到87-kDa活化形式。

3.4 gelE降解聚合纖維蛋白

gelE降解纖維蛋白對(duì)糞腸球菌致病機(jī)制具有重要意義。糞腸球菌聚合纖維蛋白是OG1RF（糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株）產(chǎn)生的一種分泌因子，可以降解纖維蛋白。檢測過濾后的蛋白酶突變株固體培養(yǎng)基上清液，從而檢驗(yàn)其降解纖維蛋白的能力，進(jìn)而確定gelE和sprE是否是負(fù)責(zé)此表型。細(xì)菌分泌的蛋白酶破壞宿主組織，使細(xì)菌遷移和擴(kuò)散。糞腸球菌感染血液，腸球菌心內(nèi)膜炎增殖體形成過程中可能涂有聚合纖維蛋白?？梢约せ頵sr系統(tǒng)中的增殖體，導(dǎo)致gelE誘導(dǎo)表達(dá)。纖維蛋白層周圍的菌降解將使有機(jī)體進(jìn)一步擴(kuò)散。

3.5 gelE生物合成-激活外信息素

糞腸球菌2個(gè)毒力相關(guān)蛋白酶明膠酶（gelE）和絲氨酸蛋白酶（sprE）的表達(dá)，是由fsr基因簇編碼的密度感應(yīng)系統(tǒng)正調(diào)控的。在此系統(tǒng)中，糞腸球菌分泌一種自誘導(dǎo)信號(hào)肽，明膠酶生物合成激活信息素（GBAP）觸發(fā)fsrC-fsrA雙組分調(diào)控系統(tǒng)控制2個(gè)轉(zhuǎn)錄物fsrBDC和gelE-sprE的表達(dá)。C. M. Waters等[10]將篩選出來的放線菌代謝物作為fsr群體感應(yīng)的抑制劑。糞腸球菌與每個(gè)放線菌培養(yǎng)物上清液培養(yǎng)測試，并分別用第1次篩選和第2次篩選對(duì)明膠酶的生產(chǎn)和明膠酶生物合成激活信息素的生產(chǎn)進(jìn)行了檢查。Y33-1株鏈霉菌的培養(yǎng)物上清液對(duì)明膠酶生產(chǎn)和明膠酶生物合成激活信息素生產(chǎn)有明顯的抑制作用，而對(duì)糞腸桿菌細(xì)胞生長沒有抑制作用。培養(yǎng)物上清液中的抑制成分是一種多肽抗素siamycin I[11]。Siamycin I在亞微摩爾濃度抑制明膠酶和明膠酶生物合成激活信息素的生產(chǎn)，并在微摩爾濃度以上抑制糞腸球菌細(xì)胞生長。定量分析fsrBDC和gelE-sprE轉(zhuǎn)錄物顯示，siamycin I在亞致死濃度下抑制兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。即使向培養(yǎng)物外加過量的明膠酶生物合成激活信息素，siamycin I還是抑制明膠酶生產(chǎn)。這些結(jié)果表明，siamycin I以非競爭性方式，通過fsrC-fsrA雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)抑制GBAP的信號(hào)肽。亞致死濃度的siamycin I也抑制生物膜的形成。

4 明膠酶調(diào)節(jié)器fsr和絲氨酸蛋白酶（sprE）

4.1 fsr調(diào)節(jié)器

糞腸球菌產(chǎn)生金屬蛋白酶，可以降解宿主細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)分子。大約有60%的糞腸球菌臨床分離株產(chǎn)生金屬蛋白明膠酶。明膠酶的表達(dá)是通過控制總體的毒力調(diào)節(jié)位點(diǎn)fsr[12]。明膠酶基因上游和絲氨酸蛋白酶基因下游發(fā)現(xiàn)3個(gè)agr相似基因fsrA，fsrB和fsrC，X. Qin等[13]試驗(yàn)表明agr相似基因可能是自我調(diào)控，而且他們調(diào)節(jié)gelE和sprE表達(dá)，且gelE和fsr均是產(chǎn)生明膠酶所必需的。測試的fsrA，fsrB，sprE突變株小鼠腹膜炎模型顯示，與OG1RF標(biāo)準(zhǔn)株相比，sprE和agr相似基因突變株非常顯著的延長了小鼠的存活時(shí)間，與此前報(bào)道有相似的發(fā)現(xiàn)。在這個(gè)模型中，sprE和agr相似基因有助于增強(qiáng)糞腸桿菌OG1RF株的毒力。幾個(gè)使用動(dòng)物或線蟲模型的體內(nèi)研究已經(jīng)表明，fsr系統(tǒng)有助于提高毒力[14]。

fsr位點(diǎn)包含4個(gè)基因，分別為fsrA、fsrB、fsrC和fsrD。在該系統(tǒng)中，明膠酶生物合成激活信息素（GBAP）形成一個(gè)環(huán)狀肽，作為自誘導(dǎo)肽。GBAP的前多肽原是由fsrD翻譯，然后經(jīng)FsrB誘導(dǎo)處理，從而使GBAP達(dá)到成熟形式。當(dāng)GBAP細(xì)胞外濃度積累達(dá)到閾值水平時(shí)，約為1 nm，它則觸發(fā)由組氨酸激酶（fsrC）和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（fsrA）組成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)。活化的fsrA誘導(dǎo)fsrBDC轉(zhuǎn)錄表達(dá)，它包含一個(gè)自動(dòng)調(diào)節(jié)的循環(huán)，產(chǎn)生一種GBAP信號(hào)肽輔助劑，并最終誘導(dǎo)gelE-sprE轉(zhuǎn)錄。

4.2 絲氨酸蛋白酶（sprE）

吳等[15]利用BLAST將肺炎鏈球菌htrA蛋白酶編碼基因與糞腸球菌染色體基因組進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌有一個(gè)全長為851 bp的開放性閱讀框與肺炎鏈球菌htrA基因有較高的同源性，被命名為sprE。進(jìn)一步研究表明，sprE基因在細(xì)菌抵抗外界溫度環(huán)境中具有一定的作用，sprE基因在細(xì)菌抵抗外界氧化環(huán)境中也有重要作用。sprE基因可能是糞腸球菌抵抗宿主內(nèi)環(huán)境以及致病較為重要的因子，能夠通過對(duì)它的突變降低糞腸球菌的毒力，獲得減毒的糞腸球菌菌株[16]。

5 結(jié)語

腸球菌醫(yī)院感染病例逐漸上升，耐藥菌株日益增多，因此研究細(xì)菌生物被膜形成的相關(guān)遺傳基因調(diào)控，維持機(jī)制以及和細(xì)菌耐藥性之間的關(guān)系有十分重要的意義。通過不斷深入研究，一定能找到治療細(xì)菌生物被膜菌有關(guān)的感染疾病的有效途徑，為新型減毒活疫苗的研究提供線索，為發(fā)現(xiàn)新途徑攻克細(xì)菌耐藥難題奠定理論基礎(chǔ)。

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