李輝亮　郭冬　汪晗　楊子平　彭世清

摘 要 通過同源克隆和RACE方法獲得了巴西橡膠樹DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase， MET）基因（HbMET）。HbMET長4 896 bp，含有4 635 bp的閱讀框架，編碼1 545個氨基酸。蛋白分子量174.36 ku，等電點為6.36。氨基酸序列與可可、毛果楊、黃瓜、擬南芥、碧桃、葡萄和煙草等物種的MET家族成員的同源性分別為73%、77%、74%、56%、72%和68%。進化樹分析表明，HbMET氨基酸序列與毛果楊的MET親緣關(guān)系最近。HbMET在巴西橡膠樹的根、樹皮、葉、膠乳中均有表達，其中在膠乳中表達量最低；HbMET在橡膠樹自根幼態(tài)無性系的膠乳中表達比老態(tài)無性系膠乳中的表達低。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；自根幼態(tài)無性系；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；表達；DNA甲基化

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

目前生產(chǎn)中種植的橡膠樹是通過對優(yōu)良品種嫁接獲得的，由于在嫁接過程中所用的砧木是未經(jīng)選擇的實生苗，同時嫁接后由于砧木和接穗的相互作用，造成種植的橡膠樹會出現(xiàn)不同個體之間生長的差異和產(chǎn)膠的差異[1-3]。中國學者首次以橡膠樹花藥為外植體通過體細胞發(fā)生途徑獲得了再生植株[4-5]。由于再生植株具有自己的根系，擺脫了砧木的影響并恢復了幼態(tài)的特性，稱為自根幼態(tài)無性系[2，6]。與嫁接苗相比，自根幼態(tài)無性系具有生長速度快、干膠產(chǎn)量高、抗逆性強的特點[6-9]。自根幼態(tài)無性系與供體（老態(tài)無性系）差異產(chǎn)生的原因尚不清楚。以前對差異產(chǎn)生的原因研究主要集中在形態(tài)學觀察、排膠生理參數(shù)等方面，如樹的莖圍、乳管層數(shù)、堵塞指數(shù)和黃色體破裂指數(shù)、膠乳中糖、無機磷含量和干膠含量等，綜合相關(guān)研究結(jié)果，自根幼態(tài)無性系高產(chǎn)的構(gòu)成因子主要有：較快的生長速度、較多的乳管列數(shù)目、較好的排膠和產(chǎn)膠生理特性[6-9]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)在自根幼態(tài)無性系的膠乳和老態(tài)無性系的膠乳中存在一些基因和蛋白的差異表達，初步證實了在自根幼態(tài)無性系中膠乳上調(diào)表達的基因有95個，下調(diào)表達的基因有26個，同時發(fā)現(xiàn)在橡膠樹自根幼態(tài)無性系中13個蛋白上調(diào)表達，11個蛋白下調(diào)表達[10-15]。推測這些基因和蛋白的差異表達是自根幼態(tài)無性系和老態(tài)無性系的產(chǎn)量差異產(chǎn)生的根本原因。橡膠樹自根幼態(tài)無性系是由供體通過無性繁殖獲得的，自根幼態(tài)無性系和供體的遺傳背景是相同的，所含遺傳物質(zhì)DNA在堿基序列是相同的，正常條件下橡膠樹的無性繁殖不可能改變遺傳物質(zhì)DNA的堿基序列，因此自根幼態(tài)無性系與其供體差異的產(chǎn)生很可能與表觀遺傳相關(guān)。李輝亮[16]證實了橡膠樹自根幼態(tài)無性系與供體基因組DNA之間存在甲基化多態(tài)性的差異，進一步表明自根幼態(tài)無性系與其供體差異的產(chǎn)生與表觀遺傳相關(guān)。

表觀遺傳是指不因DNA序列的變化而形成基因功能的改變，這種改變是細胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞[17]。表觀遺傳的分子機制包括DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質(zhì)改型和小RNA干擾等。甲基化是DNA化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)，是調(diào)節(jié)基因功能的重要手段[18]。它通過一系列DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來建立和維持DNA甲基化模式[19]。在植物中目前發(fā)現(xiàn)至少有MET甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase， MET）、染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase， CMT）和域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（Domains Rearranged Methyltransferase， DRM）3類在結(jié)構(gòu)和功能上不同的胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶[19-27]。為了研究橡膠樹自根幼態(tài)無性系高產(chǎn)與DNA甲基化的關(guān)系，本課題組對橡膠樹的3類胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶基因進行了克隆和表達分析等相關(guān)研究。本研究將報道巴西橡膠樹DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase， MET）基因（HbMET）的克隆和表達，該結(jié)果為進一步研究橡膠樹自根幼態(tài)無性系高產(chǎn)與DNA甲基化的關(guān)系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）海墾2號自根幼態(tài)無性系及其供體老態(tài)無性系種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院試驗場。所用膠乳的采集按照Tang等[28]的方法進行。根、葉和樹皮采集后用液氮研磨，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質(zhì)粒、菌種及試劑 3′-full RACE試劑盒和RNA PCR（AMV）Ver.3.0試劑盒購自TaKaRa公司。Taq DNA Polymerase 和T4-DNA連接酶dNTPs、IPTG、X-gal購于Promega公司。E.coli DH5α菌株由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 參照Tang等[28]的方法進行。

1.2.2 HbMET的擴增 根據(jù)已報道的植物MET基因家族保守序列設計簡并引物，通過PCR獲得HbMET片段序列，再根據(jù)HbMET片段序列設計3′RACE引物。cDNA的合成和3′RACE擴增按照3′-full RACE試劑盒使用說明書進行。實驗所用引物見表1。

1.2.3 HbMET同源性分析和進化樹構(gòu)建 利用DNAMAN軟件分析HbMET蛋白與其它植物MET家族的同源性和進化樹構(gòu)建。

1.2.4 HbMET定量PCR分析 以HbACT基因為內(nèi)參對照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ進行定量PCR分析，基因的相對表達量按BIO-RAD CFX96熒光定量儀使用說明進行分析。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)。PCR引物見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbMET的克隆

根據(jù)已有植物的MET基因家族保守序列設計簡并引物，通過PCR獲得了HbMET的3個片段，分別為1 725 bp（HbMET1）、1 584 bp（HbMET2）和1 525 bp（HbMET3）（圖1）。利用DNAMAN軟件對這3個片段進行拼接。根據(jù)拼接獲得的片段設計3′RACE引物，通過3′-RACE擴增技術(shù)得到一個551 bp的 3′片段（圖1）。將保守區(qū)片段與3′端片段進行拼接，得到一個長4 896 bp的序列（命名為HbMET）。該序列含有4 635 bp的開放式閱讀框架，3′端有248 bp的非編碼區(qū)，其中含有一條18個堿基的polyA尾，預測該基因編碼1 545個氨基酸（圖2），分子量174.36 ku，等電點為6.36。

2.2 HbMET生物信息學分析

將HbMET氨基酸序列與其它植物的MET比較，發(fā)現(xiàn)HbMET與可可（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）、黃瓜（Cucumis sativus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、碧桃（Prunus persica）、葡萄（Vitis vinifera）和煙草（Nicotiana tabacum）等物種的MET家族成員的同源性分別達到為73%、77%、74%、56%、72%和68%（圖3）。構(gòu)建的進化樹表明，HbMET與毛果楊的MET親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.3 HbMET在自根幼態(tài)無性系組織特異性表達

對HbMET在自根幼態(tài)無性系的根、皮、花、葉和膠乳中的表達進行了定量PCR分析，結(jié)果表明，HbMET在根中的表達最高，其次是在葉和樹皮中表達，膠乳中表達量最低（圖5）。

2.4 HbMET在自根幼態(tài)無性系與其供體膠乳的差異表達

天然橡膠是在橡膠樹的乳管中合成的，膠乳實質(zhì)上是乳管細胞的細胞質(zhì)[29]。乳管細胞中基因的表達與天然橡膠生物合成直接相關(guān)。為了解HbMET在自根幼態(tài)無性系與其供體膠乳的表達是否存在差異，對HbMET在自根幼態(tài)無性系和其供體膠乳的進行定量PCR分析， 結(jié)果表明，HbMET在自根幼態(tài)無性系的表達比其供體膠乳的表達低（圖6）。

3 討論與結(jié)論

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑之一，大量研究結(jié)果表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達[17]。DNA甲基化主要是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族來催化完成的[19-21]。目前一些植物的MET基因已經(jīng)克隆并進行了相關(guān)研究[21-23]，但是到目前為止還未見橡膠樹MET基因研究的報道。本研究首次從橡膠樹中克隆了MET基因HbMET，同源性和分子進化分析表明，推導的HbMET是一種與植物DNA甲基化相關(guān)的甲基化酶。過去關(guān)于巴西橡膠樹自根幼態(tài)無性系和供體差異產(chǎn)生的原因的研究主要集中在對自根幼態(tài)無性系高產(chǎn)構(gòu)成的形態(tài)和生理指標[6-9]，以及膠乳中差異表達基因和蛋白的鑒定[10-15]。而從表觀遺傳的角度來分析自根幼態(tài)無性系和供體差異有可能闡明自根幼態(tài)無性系高產(chǎn)產(chǎn)生的根本原因。天然橡膠是橡膠樹乳管細胞中合成的，膠乳是乳管細胞的細胞質(zhì)[29]。本研究結(jié)果表明，HbMET在自根幼態(tài)無性系膠乳中的表達比其供體膠乳的表達低，可能在自根幼態(tài)無性系乳管細胞中DNA甲基化程度較供體乳管細胞的低，DNA甲基化可調(diào)控特定的基因表達，而植物啟動子區(qū)的DNA甲基化通常抑制轉(zhuǎn)錄[21-22]。推測由于自根幼態(tài)無性系和供體乳管細胞中DNA甲基化的差異，使得自根幼態(tài)無性系和供體乳管細胞中基因的表達出現(xiàn)差異，從而導致巴西橡膠樹自根幼態(tài)無性系和供體在產(chǎn)膠能力等方面的差異，但這一推測還需進一步深入研究。

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