楊華麗 呂恃衡 蔡韡韡 鄭鴻昌 潘東明 李子真 陳桂信

摘 ?要 ?為探究夜來香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代謝中的調控作用，以花瓣為材料，采用RT-PCR和RACE技術相結合，克隆夜來香SAMT基因的全長cDNA。結果表明：該cDNA的序列長度為1 493 bp，編碼365個氨基酸，其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR，將其命名為CnSAMT;生物信息學分析結果表明：該基因所編碼的氨基酸序列與煙草、番茄的同源性分別為98%和98%，屬于甲基轉移酶-7家族;原核表達結果表明：CnSAMT的蛋白表達產(chǎn)物約為42 ku，與軟件預測的結果大致相同。采用染色體步移技術，克隆夜來香CnSAMT的5′端調控序列，結果表明：該序列長度為993 bp，且該序列除了含有TATA-box、CAAT-box等啟動子核心元件外，還含有光、生長素、脫落酸、熱脅迫、缺氧脅迫等外界環(huán)境條件響應的順式作用元件。

關鍵詞 ?夜來香;SAMT基因;原核表達;5′端調控序列

中圖分類號 ?Q949.777.7 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Isolation and Prokaryotic Expression of SAMT

Gene from Cestrum nocturnum

YANG Huali1， Lü Shiheng1*， CAI Weiwei1， ZHENG Hongchang2，

PAN Dongming1**， LI Zizhen3， CHEN Guixin1**

1 Institute of Storage Science and Technology of Horticultural Products， Fujian

Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Agriculture Bureau of Yong'an City， Yong'an， Fujian 366000， China

3 College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?A full-length cDNA encoding SAMT named CnSAMT with length 1 493 bp， encoding 365 amino acids， including 130 bp 5′UTR， 1 098 bp ORF， ?265 bp 3′UTR， was cloned by the combination of RT-PCR and RACE from Cestrum nocturnum petals， to explore the mechanism of the formation of fragrance in C. nocturnum. Bioinformatics analysis showed that the amino acid sequence was 98% homology with Nicotiana tabacum and 98% identity with Solanum lycopersicum， belonging to Methyltransf-7 superfamily. The product of prokaryotic expression of CnSAMT gene was about 42 ku. The molecular weight was consistent with the predicted by software. A regulatory sequence of the 5′ terminal in CnSAMT with 993 bp in length was cloned by genomic walking technology and the result of sequence analysis showed that the regulatory sequence contained core elements such as TATA-box， etc. and other cis-acting elements responding for environmental conditions such as light， auxins， ABA， heat stress and anaerobic tress， and so on.

Key words ?Cestrum nocturnum;SAMT gene;Prokaryotic expression;Regulatory sequence of the 5′ terminal

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.018

夜來香（Cestrum nocturnum）為茄科（Solanaceae）夜香樹屬（Cestrum）植物，又名夜香樹，原產(chǎn)于南美洲，在中國福建、廣西、廣東、云南等地皆有栽培[1]，其呈現(xiàn)獨特的開花習性，白天花瓣閉合，夜間花瓣開放，花香濃郁。自仙女扇（Clarkia breweri）芳樟醇合成酶基因（LIS基因）被成功克隆后，越來越多的花香相關基因陸續(xù)被克隆，也開始了花香基因工程研究[2-4]。水楊酸羧甲基轉移酶（salicylic acid carboxyl methyltransferase， SAMT）以水楊酸（salicylic acid， SA）為受體催化供體S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl -L-methionine， SAM）上的甲基轉移到水楊酸的羧基上，形成水楊酸甲酯（methyl salicylate，MeSA）的反應[5]，參與花香物質合成途徑的調控[2]。目前，對于SAMT的研究集中在花香揮發(fā)性成分合成機制、植物防御系統(tǒng)、酶學特性研究等方面。Ross等[5]從仙女扇花瓣中分離純化得到一個約40 ku的推測SAMT蛋白，并由此蛋白的序列設計探針，從仙女扇花瓣cDNA文庫中分離出cDNA的全長，該基因在大腸桿菌中的原核表達產(chǎn)物為一個約40.3 ku的蛋白，該蛋白與天然純化SAMT蛋白具有相同的特性，能催化SA和SAM形成MeSA，由此證明該基因的表達產(chǎn)物為SAMT。此后，非洲茉莉（Stephanotis floribunda）[6]、薇甘菊（Mikania micrantha）[7]、 臘梅（Chimonanthus praecox）[8]、 中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）[9]等植物的SAMT基因相繼被克隆， SAMT的活性也在非洲茉莉、 花煙草（Nicotiana alata）、 林煙草（Nicotiana sylvestris）、 球蘭（Hoya carnosa）等植物中得到進一步檢測和驗證[6，10]。Martins等[11]從夜來香的葉片中獲得了SAMT基因片段。

本研究采用RT-PCR和RACE技術相結合，分離夜來香花瓣SAMT基因的全長cDNA，采用染色體步移技術分離該基因的5′端調控序列，對該序列的順式作用元件進行分析，并對該基因進行原核表達研究，以期從分子水平上闡明SAMT基因在夜來香花香代謝中的調控機制，為夜來香花香的改良提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試植株夜來香種植在福建農林大學校內，于2012 年7月下旬采集正常生長花瓣（分時間段）、成熟葉片，裝入鋁箔袋并標記，放入液氮罐帶回實驗室，立即貯藏于-80 ℃冰箱備用。

RNAiso Plus試劑、Ex Taq、dNTPs、pMD18-T載體、DL2000 Maker購自寶生物工程（大連）有限公司;TransTaq HiFi DNA Polymerase、pEASY-E1載體購自北京全式金生物技術有限公司;DH5α感受態(tài)細胞、質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司; APAgeneTM Gold Walking kit購自加拿大Bio S&T Inc公司;大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞為所在研究所制備與保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?夜來香SAMT基因全長cDNA的克隆 ? 夜來香花瓣總RNA的提取采用RNAiso Plus試劑對夜來香不同時間段的花瓣混合樣進行總RNA的提取，采用超微量分光光度計、1%瓊脂糖凝膠電泳對總RNA純度、含量進行檢測。參照鄭鴻昌[12]改良的方法進行RT-PCR合成雙鏈cDNA。根據(jù)GenBank登錄號為AY741483.1的夜來香SAMT基因部分編碼序列，利用Primer Premier 5軟件設計3′RACE、5′RACE引物（見表1），3′RACE、5′ RACE特異接頭引物參照鄭鴻昌[12]改良的方法設計。引物合成與測序由上海博尚生物技術有限公司完成。

以夜來香雙鏈cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為：總體積為25 μL，包括Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，cDNA模板 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，最后用ddH2O補加至25 μL;反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，按不同條件（3′RACE：55 ℃;5′RACE：第一輪56 ℃，第二輪56 ℃，第一輪PCR產(chǎn)物做模板且模板稀釋100倍使用）退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃結束。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物并回收目的條帶，連接到pMD18-T載體上，化學轉化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，菌液PCR鑒定，測序。利用NCBI網(wǎng)站、DNAMAN軟件對測序序列進行分析。

根據(jù)所獲得的3′端序列、5′端序列和已報道的SAMT基因部分編碼序列進行SAMT基因cDNA全長的拼接，并將所獲序列命名為CnSAMT。

1.2.2 ?夜來香SAMT基因全長cDNA的生物信息學分析 ? 對所獲得的夜來香SAMT基因cDNA全長進行生物信息學分析：利用BLAST（http：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行氨基酸序列同源性分析;利用MEGA5.2軟件構建系統(tǒng)進化樹;利用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）、ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進行蛋白質基本理化性質預測;利用PSORT Prediction（http：//psort.hgc.jp/form. html）、TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進行蛋白質亞細胞定位預測;利用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行蛋白質磷酸化位點預測。

1.2.3 ?夜來香SAMT基因原核表達質粒的構建與表達 ? 根據(jù)拼接的夜來香SAMT基因全長序列，利用軟件Primer Premier 5設計開放閱讀框（ORF）的上下游引物（見表1）。擴增SAMT基因的ORF：其反應體系的總體積為25 μL，其中包括HiFi DNA Polymerase（5 U/μL） 0.25 μL，10×HiFi buffer Ⅱ 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，cDNA模板 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，最后用ddH2O加至25 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃結束。電泳檢測確定PCR擴增產(chǎn)物為SAMT基因的ORF后，PCR產(chǎn)物參照pEASY-E1載體說明書進行連接，化學轉化DH5α感受態(tài)細胞，接著進行菌液PCR鑒定、測序及序列分析。陽性菌液以1 ∶ 50比例接種于5 mL LB（Ampr）液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)過夜，使用質粒小提試劑盒進行菌液質粒的提取，獲得重組表達質粒pEASY-E1-CnSAMT。

將重組質粒pEASY-E1-CnSAMT轉化BL21感受態(tài)細胞，加入400 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，全部轉接入5 mL LB（Ampr）液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)物按1 ∶ 50比例轉接到各含有4 mL的LB（Ampr）液體培養(yǎng)基的2個試管中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6，將2個分為處理組和對照組，向處理組試管中加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導培養(yǎng)，于培養(yǎng)0、4、6、8 h分別收集處理組和對照組各500 μL菌液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心1 min，棄上清液。向菌體沉淀中加入50 μL 1×SDS上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，2% SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油，0.1 mol/L二硫蘇糖醇），懸浮沉淀，100 ℃沸水浴5～10 min，立即冰浴冷卻。12 ?000 r/min離心2 min，取5 μL上清液進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 ?夜來香SAMT基因5′端調控序列的克隆 ? 采用CTAB法對夜來香成熟葉片基因組DNA進行提取，根據(jù)所獲夜來香SAMT基因全長序列設計3條巢式引物（見表2）。參照APAgeneTM Gold Walking kit試劑盒說明書，以夜來香基因組DNA為模板，進行SAMT基因5′端調控序列的PCR擴增，然后對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測、目的條帶回收、連接、轉化、測序，最后利用PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對測序序列進行啟動子作用元件分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?夜來香SAMT基因全長cDNA序列的獲得與分析

從圖1可看出，夜來香花瓣總RNA質量較好，條帶清晰完整，無DNA和其他物質污染。分光光度計檢測結果顯示，總RNA濃度約為1 μg/μL，OD260/280處在1.8～2.0，此結果說明所提取的總RNA純度、含量均較高。對所獲得3′端序列、5′端序列（圖2）和已報道的SAMT基因部分編碼序列進行拼接，獲得了夜來香SAMT基因的cDNA全長，并將所獲序列命名為CnSAMT（圖3）。CnSAMT全長為1 493 bp，編碼365個氨基酸，包含130 bp 5′非編碼區(qū)（UTR）、1 098 bp開放閱讀框（ORF，131～1 228）、265 bp 3′非編碼區(qū)（UTR）。

2.2 ?夜來香SAMT基因的生物信息學分析

2.2.1 ?夜來香SAMT基因的氨基酸序列同源性和進化分析 ? 將CnSAMT的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結果發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列為甲基轉移酶-7家族（methyltransf-7 superfamily），與毛莖夜香樹（Cestrum elegans）SAMT氨基酸序列的相似度為90%，與花煙草（Nicotiana alata）、煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）的相似度均為98%，這說明克隆的基因為夜來香SAMT基因。

選取13種植物的SAMT氨基酸序列與CnSAMT氨基酸序列構建NJ系統(tǒng)進化樹（圖4）。不同科屬類植物之間SAMT氨基酸序列呈現(xiàn)明顯差異，該系統(tǒng)進化樹基本表明了各植物種類間的親緣關系。茄科類植物的SAMT氨基酸序列與其他科類植物有明顯差異，以100%的bootstrap支持度形成一個分支。在此分支下，不同屬植物種類分別形成一個分類群，CnSAMT氨基酸序列與毛莖夜香樹SAMT氨基酸序列又以100%的bootstrap支持度形成一個分類群。CnSAMT氨基酸序列樹枝長度大于毛莖夜香樹SAMT氨基酸序列，這表明該拷貝蛋白質序列發(fā)生了變化。

2.2.2 ?夜來香SAMT蛋白質基本理化性質的預測與分析 ? 推測CnSAMT基因編碼365個氨基酸，分子量為41 592.3 u，分子式為C1873H2879N473O562S18，等電點為5.14，蛋白不穩(wěn)定，總平均親水性（GRAVY）為-0.238。CnSAMT含有20種氨基酸，其中成分較多的為谷氨酸（Glu，9.9%）、絲氨酸（Ser，9.6%）、亮氨酸（Leu，8.8%）等。帶負電荷殘基數(shù)（酸性氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸）為48個，帶正電荷殘基數(shù)（堿性氨基酸：精氨酸和賴氨酸）為34個。親水性域比疏水性域所占比例大，推測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.3 ?夜來香SAMT蛋白亞細胞定位、磷酸化位點的預測與分析 ? CnSAMT定位于細胞質的可能性最大為45%，葉綠體轉運肽（chloroplast transit peptide， cTP）值為0.028， 線粒體靶向肽（mitochondrial targeting peptide， mTP）值為0.078，分泌通路信號肽（secretory pathway signal peptide， SP）值為0.339， 結果推測該蛋白無信號肽，屬于非分泌型蛋白，最有可能定位于細胞質中。該蛋白可能發(fā)生磷酸化的位點有14 個，包括8 個絲氨酸（Ser）位點、3 個蘇氨酸（Thr）位點、3 個酪氨酸（Try）位點。各自分別在肽鏈第26、65、92、186、207、225、230、260 位，第56、182、267 位，第22、266、275 位。

2.3 ?夜來香SAMT基因的原核表達分析

利用SDS-PAGE檢測pEASY-E1-CnSAMT表達蛋白的結果見圖5，處理組在37 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導條件下，pEASY-E1-CnSAMT在大腸桿菌中誘導4、6、8 h皆有大量蛋白表達，蛋白條帶約為42 ku，且誘導6、8 h與4 h的蛋白表達量相同，即在4 h蛋白表達量達最大;而對照組在37 ℃、未經(jīng)IPTG誘導條件下，pEASY-E1-CnSAMT在大腸桿菌中培養(yǎng)4、6、8 h皆沒有大量蛋白表達。綜上所述，表達蛋白與所預測的CnSAMT（約41.59 ku）的大小大致相同。

2.4 ?夜來香SAMT基因5′端調控序列的克隆與序列分析

從圖6可看出，采用Walking試劑盒中的第2種DRT（Degenerate random tag）隨機引物進行PCR擴增，結果獲得約1 000 bp的目的條帶并回收純化;測序結果顯示，分離得到一條1 045 bp CnSAMT 5′端調控序列，與CnSAMT序列進行比對，確定分離得到了CnSAMT 的993 bp ?5′端調控序列。由圖7可知，在起始密碼子上游-60 pb和-69 pb之間推測存在有TATA-box，在-89 pb和-92 pb之間存在CAAT-box，該序列還存在許多光響應相關元件，如ATCT-motif、Box4、BoxI、Sp1、GT1-motif、G-box等。同時，該序列上還存在著其他與植物開花和防御相關的元件，如生長素響應元件TGA-element，熱脅迫響應順式作用元件HSE，缺氧誘導響應順式作用元件ARE等。該序列中大量的光響應相關元件和植物生長發(fā)育相關元件的存在可能暗示CnSAMT的表達受光反應和逆境的調控。

3 ?討論與結論

調控花香物質主要合成途徑中有3個最重要的基因家族，分別為氧位甲基轉移酶基因家族、酰基轉移酶基因家族、萜類合成酶基因家族。而根據(jù)蛋白序列同源關系可將氧位甲基轉移酶基因家族分為3個類群，SAMT位于第三類群SABATH甲基轉移酶（SABATHMTs）中[13-14]。本研究從夜來香的花瓣中分離得到CnSAMT，編碼365個氨基酸，屬于甲基轉移酶-7家族，為SABATHMTs，這將為進一步開展夜來香花香代謝途徑調控機制的研究奠定基礎。

在植物中SAMT參與花香物質水楊酸甲酯合成的調控，ROSS等[5]研究證實了在仙女扇中，SAMT可以腺苷甲硫氨酸或苯甲酸為底物，催化形成水楊酸甲酯和少量的苯甲酸甲酯。非洲茉莉同樣也釋放了這2種香氣物質[6，15]。番茄SISAMT對于水楊酸甲酯的合成也至關重要[16]。此外，對CnSAMT氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，夜來香與茄科類其他植物SAMT序列有較高的相似度，如CnSAMT與番茄、煙草SAMT序列相似度均為98%，在系統(tǒng)進化樹分析中，茄科類植物也以100% bootstrap支持度同在一個分支中，CnSAMT與煙草SAMT、番茄SAMT的親緣關系較近，但與中國水仙、擬南芥等不同科的植株SAMT的親緣關系較遠。初步推測，茄科類植物SAMT蛋白功能相似具有較大的可能性，CnSAMT在夜來香花香代謝中有可能發(fā)揮著合成水楊酸甲酯或苯甲酸甲酯的重要作用。但要證實CnSAMT在夜來香花香代謝中的具體功能，必須在蛋白質水平上進行深入研究。本研究對CnSAMT氨基酸序列的蛋白質基本理化性質、蛋白亞細胞定位、磷酸化位點的預測與分析顯示，CnSAMT可能為親水性蛋白，無信號肽，非分泌型蛋白，最有可能定位于細胞質中;同屬SABATHMTs的BAMT被證實在金魚草花瓣細胞質中大量表達[17]，因此推測CnSAMT有可能為胞漿蛋白。預測CnSAMT可能發(fā)生磷酸化的位點為14 個，即CnSAMT可能通過蛋白磷酸化對蛋白進行修飾達到調控蛋白結構、功能的作用。另外，對CnSAMT進行原核表達分析，CnSAMT在大腸桿菌中成功表達，為研究CnSAMT蛋白純化、酶學特性奠定了基礎。

同時，本研究首次從夜來香上分離得到993 bp CnSAMT 5′端調控序列。非洲茉莉MeSA每日波動有可能涉及SAMT mRNA的積累和SAMT活動導致的揮發(fā)性物質合成[6]。體外噴灑SA能誘導激活MmSAMT，其表達量升高[7]。啟動子上響應水楊酸信號可能誘導SAMT表達，合成MeSA。但在CnSAMT 5′端調控序列推測分析中并未發(fā)現(xiàn)與水楊酸信號相關響應元件，為尋找CnSAMT 5′端調控序列中響應水楊酸核心元件，需進一步鑒定5′端調控序列的功能。

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