吳菁華 吳少華 楊超 張志忠 林文雄

摘 ?要 ?MADS-box基因在植物花發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。為了研究D類MADS-box基因在中國水仙花發(fā)育中的功能，本實(shí)驗(yàn)采用RACE和RT-PCR技術(shù)從中國水仙‘金盞銀臺中分離到1個MADS-box基因，命名為NtSTK。該基因含有1個705 bp的開放閱讀框，編碼234個氨基酸，并且該基因在3個不同類型的中國水仙中序列差異較小。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示NtSTK屬于D類MADS-box基因。熒光定量分析表明該基因在‘金盞銀臺和‘玉玲瓏的雌蕊和子房中表達(dá)水平較高，在根和葉片中低水平表達(dá)，在花被和雄蕊及鱗莖中不表達(dá)。

關(guān)鍵詞 ?中國水仙;MADS-box基因;NtSTK基因;花發(fā)育

中圖分類號 ?S682.21 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

cDNA Cloning， Sequence Analysis and Tissue Expression

of NtSTK in Narcissus tazetta var. chinensis

WU Jinghua1， WU Shaohua1， YANG Chao1， ZHANG Zhizhong1， LIN Wenxiong2

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Institute of Agroecology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?MADS-box genes play an important role in flower development. To investigate the function of D-class gene on flower development in Chinese narcissus， A MADS-box gene， named NtSTK， was cloned from‘Jinzhanyintaiflower buds by RACE and RT-PCR. The ORF of NtSTK is 705 bp in length that putatively encodes a protein with 234 amino acids. Sequence analysis indicated little differences among the three NtSTK genes cloned from Chinese narcissus. Homology analysis showed that the NtSTK was a D-class MADS-box gene. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that NtSTK was expressed higher levels in pistil and ovary from‘Jinzhanyintaiand‘Yulinglong， with low expression in leaf and root and no expression in perianth， stamen and bulb.

Key words ?Narcissus tazetta var. chinensis; MADS-box gene; NtSTK gene; Flower development

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.016

植物花器官發(fā)育近年來成為發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，繼花發(fā)育ABC模型提出后，學(xué)者又不斷的進(jìn)行補(bǔ)充和完善，提出了ABCDE模型[1-3]。此模型中基因大部分屬于MADS-box基因家族，該家族基因都具有MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，參與了多種植物生命活動，如調(diào)節(jié)植物開花時間[4]、花器官發(fā)育[5-6]、果實(shí)發(fā)育[7]、組織分化[8]和根、葉等營養(yǎng)器官的發(fā)育[9-10]。

到目前為止，在所有主要的種子植物中都發(fā)現(xiàn)有AGAMOUS基因（AG基因）。AG基因在被子植物和裸子植物分化之后、被子植物進(jìn)化早期發(fā)生了一次重要的基因重復(fù)事件，產(chǎn)生了C類和D類基因，C類基因可進(jìn)一步分為兩亞進(jìn)化枝：euAG亞進(jìn)化枝和PLENA亞進(jìn)化枝[11-12]。根據(jù)ABCDE模型，B、C和E基因調(diào)控形成花瓣和雄蕊;C和E基因調(diào)控心皮形態(tài)發(fā)生;D和E基因是參與胚珠的發(fā)育。這些基因產(chǎn)物構(gòu)成多聚體調(diào)控復(fù)合體通過識別目標(biāo)基因特定的順式元件來調(diào)控花器官的發(fā)育[13-15]。

中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）是福建省的特色花卉，具有極高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價值。目前關(guān)于中國水仙花發(fā)育相關(guān)的報道較少[16-19]，主要集中在B類、C類和E類基因中，未見關(guān)于D類基因的報道。本研究以中國水仙3個品種為材料，利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆STK基因，并對其表達(dá)模式進(jìn)行了分析。本實(shí)驗(yàn)為分析花發(fā)育ABCDE模型在單子葉植物中的適用性提供材料，同時也為闡明水仙花發(fā)育機(jī)理和利用分子生物學(xué)手段對水仙進(jìn)行遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

‘金盞銀臺和‘玉玲瓏來自于福建省漳州市的2個中國水仙品種，平潭水仙是來自于福建省平潭綜合實(shí)驗(yàn)室的水仙種質(zhì)。分別取花芽、葉片、鱗莖以及盛花期的花瓣、副冠、雄蕊和雌蕊，液氮處理后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?中國水仙NtSTK基因的克隆 ? 采用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取中國水仙‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙花蕾的RNA，用Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成cDNA。根據(jù)Genebank中單子葉植物STK類基因保守區(qū)序列設(shè)計特異引物，NtSTK1：5′-ATGGGGAGGGGAAAGA

TTGAGATAAAGAGG-3′，NtSTK2：5′-ACCCAAGA

TGAAGGGCTGTTTG-3′，以‘金盞銀臺cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取中國水仙STK基因保守區(qū)序列。據(jù)此序列設(shè)計3′RACE引物，NtSTK3：5′-GCAGCAAAACTGCGCCATCAGATTCAG-3′，與試劑盒中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得該基因的3′端。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計NtSTK基因ORF的上游引物NtSTK4：5′-TATGAGCTCATGGGGAGGGGAAAG

ATT-3′和下游引物NtSTK5：5′-CTGTCTAGATCA

TTCTTCAGGATCAGCTT-3′，分別以‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得各品種的NtSTK基因ORF。

1.2.2 ?序列的生物信息學(xué)分析 ? 利用ExPASY系統(tǒng)中的ProtParam工具（http：//www.expasy. org/tools/ protparam.html）對水仙STK基因編碼氨基酸進(jìn)行分析，運(yùn)用Blast搜索同源基因，使用Mega5軟件對搜索獲得的基因進(jìn)行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.3 ?NtSTK基因的表達(dá)分析 ? 分別提取單瓣水仙‘金盞銀臺的花瓣、副冠、雄蕊、雌蕊、葉片、根、鱗莖、子房和重瓣水仙‘玉玲瓏的花瓣、副冠、瓣化雄蕊、瓣化雌蕊的總RNA，測定OD值后，取相同量RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍后待用。依據(jù)中國水仙NtSTK基因設(shè)計特異引物，分別為：NtSTK6：5′-GACTCACGCGGCTACTA

CCATGTC-3′，NtSTK7：5′- ACACCAATGTCCTCG

CTCCC TC-3′;用中國水仙Actin基因作為內(nèi)參基因。Actin基因上游引物：5′-TGCCCAGAAGTGCTA

TTCCAG-3′，下游引物：5′-GTTGACCCACCACTA

AGAACAATG-3′。采用兩步法熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，引物各0.4 μL，稀釋的cDNA 2 μL，補(bǔ)ddH2O到20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 s，94 ℃變性5 s，57 ℃退火20 s，50個循環(huán)。以各樣品為模板進(jìn)行分析，3次重復(fù)。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法進(jìn)行處理。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?中國水仙NtSTK基因的克隆

以中國水仙“金盞銀臺”的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了679 bp的片段（圖1）。Blast分析結(jié)果顯示，該序列與已登錄NCBI的多種植物的SEEDSTICK-like基因同源性都較高，其中與球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum，DQ 017703）、麝香百合（Lilium longiflorum，AY 522502）、雜種百合（Lilium hybrid cultivar，AB 359184）、雜種蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid cultivar，AB 232953）和垂枝樺（Betula pendula，AM 283033）的同源性分別高達(dá)80%、79%、78%、78%和76%，可推斷此片段為中國水仙STK基因的保守區(qū)片段。

根據(jù)所設(shè)計的3′RACE引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到一條約600 bp的單一條帶（圖1）。測序結(jié)果顯示與保守區(qū)有395 bp的重疊區(qū)域，出現(xiàn)的第一個終止密碼子是TGA，獲得了中國水仙NtSTK基因的3′端。

根據(jù)所設(shè)計的中國水仙NtSTK基因的ORF引物，分別對‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到ORF片段大小都為705 bp，分別命名為NtSTKJ，NtSTKY和NtSTKP。

2.2 ?中國水仙NtSTK基因生物信息學(xué)分析

將中國水仙NtSTKJ基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行blast分析，結(jié)果表明該序列與其它物種中已知的SEEDSTICK-like基因氨基酸序列具有很高的一致性，其中與天門冬（Asparagus virgatus，BAD 83772）、百子蓮（Agapanthus praecox，BAC 66963）、風(fēng)信子（Hyacinthus orientalis，AAF 08830）、小果野蕉（Musa acuminata，AAY 53908）和石斛蘭（Dendrobium nobile，ABQ 08574）等的同源性分別為91%、89%、88%、83%和82%，說明這些單子葉植物的SEEDSTICK類基因比較保守，‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙的SEEDSTICK基因相似度很高，僅有3個堿基的差異，這些差異可能是基因本身的差異，也可能是PCR擴(kuò)增或者測序誤差而導(dǎo)致的差異。

NtSTK基因編碼的氨基酸序列與不同物種STK基因氨基酸序列的比對結(jié)果（圖2）顯示，此類基因在C端都有AG類基因具有的高度保守的AGI基序和AGII基序;同時也具有單子葉植物STK類基因特有的MD基序。這些保守基序的存在說明NtSTK基因?qū)儆贒類MDAS-box基因。

為了研究STK基因的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。所有單子葉植物歸為一類，雙子葉植物歸為另一類。NtSTK與百子蓮的ApMADS2、風(fēng)信子的HoMADS1聚在一起，且與蘭科植物的STK聚在一起，說明這些單子葉植物的STK相似度較高，預(yù)示著其功能具有一定的相似性。

2.3 ?組織表達(dá)分析

實(shí)時熒光定量PCR分析結(jié)果（圖4）顯示，NtSTK基因在“金盞銀臺”和“玉玲瓏”的雌蕊和子房中表達(dá)，在葉片和根中有微量表達(dá)，在花的其它部位以及鱗莖中均不表達(dá)。由于水仙的花蕾中已包含了發(fā)育的雌蕊和子房，故NtSTK在花蕾中也有表達(dá)。

3 ?討論與結(jié)論

通過基因重復(fù)事件產(chǎn)生不同的AG進(jìn)化枝基因，這些不同類型的基因在序列上仍然比較相似，其蛋白C末端依然具有AGI基序和AGII基序[20]。在本研究中水仙的NtSTK也具有相似的基序，并且可與其它植物STK基因聚在一起，說明本實(shí)驗(yàn)分離的NtSTK基因?qū)儆贒類基因。

不同植物AG基因的表達(dá)模式有一定差異，但均主要在雌蕊和雄蕊中表達(dá)。過去認(rèn)為C類基因控制雄蕊和心皮的發(fā)育，如擬南芥中的AG[1];而D類基因參與胚珠的發(fā)育，例如矮牽牛中的FBP7和FBP11[21-22]。然而，近年來人們發(fā)現(xiàn)這2類基因的表達(dá)模式很難完全區(qū)分開。如球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum Rchb）的C類基因DthyrAG1和D類基因DthyrAG2在成熟花中的表達(dá)模式基本一致，在子房的發(fā)育過程中也均有表達(dá)[23];從蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）中克隆得到的C功能基因PhalAG1和D功能基因PhalAG2，二者在唇瓣、蕊柱及子房中都能表達(dá)，且表達(dá)情況基本沒有差異[24]。

本試驗(yàn)對獲得的NtSTK基因進(jìn)行了組織特異性表達(dá)模式研究，結(jié)果表明該基因只在中國水仙的雌蕊和子房中表達(dá)，說明NtSTK基因應(yīng)該是AG基因家族中的一員，對中國水仙雌蕊和子房的發(fā)育起著一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NtSTK（D類）在重瓣水仙“玉玲瓏”雌蕊和子房中的表達(dá)量都比在單瓣水仙“金盞銀臺”雌蕊和子房中的表達(dá)量要高，其他學(xué)者的研究表明水仙NTMADS1（C類）在中國水仙副冠、雄蕊和子房中均有表達(dá)[16]，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是中國水仙C類基因和D類基因在調(diào)控雌性生殖器官發(fā)育的過程中存在著功能冗余。

前人研究一般認(rèn)為D類基因在胚珠發(fā)育過程中起核心作用，最新的研究成果改變這一認(rèn)識。Heijmans等[25]重新分析了矮牽牛C類和D類基因的功能，在fbp7 fbp11突變體中，胚珠的發(fā)育很大程度上是不受影響，這表明胚珠的發(fā)育不僅僅是D類基因決定。當(dāng)fbp7 fbp11雙突變體與PMADS3-RNAi株系或fbp6突變體之一結(jié)合，獲得了胚珠缺失嚴(yán)重的株系。這些結(jié)果表明，所有的矮牽牛AG成員在指定胚珠身份上功能冗余，不單單由D類基因來決定胚珠的特征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也暗示水仙雌蕊和子房的發(fā)育可能受C類基因和D類基因的共同調(diào)控。

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