陽輝蓉 劉四新 李武 吳延春 胡文婷 劉翊昊 胡曉蘋 李從發(fā)

摘 ?要 ?利用活菌菌餅法和濾紙片法研究篩選64株海南粗榧內(nèi)生真菌對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的抑菌活性，并對(duì)活性菌株的代謝產(chǎn)物化學(xué)成分進(jìn)行初步測試。菌餅試驗(yàn)結(jié)果顯示，11株海南粗榧內(nèi)生真菌對(duì)無乳鏈球菌具有明顯抑制作用，占總菌株數(shù)的17.2%，抑菌圈在Φ（8.7±0.3～16.2±0.2）mm間。濾紙片試驗(yàn)結(jié)果顯示，12株具有明顯抑制作用，占總菌數(shù)的18.8%，抑菌圈在Φ（8.7±0.3～28.2±0.4）mm間。2種方法的最高活性菌株不一致，但最高活性菌株（B30、F52）和同時(shí)顯示較高活性的菌株（B14、B30、B32、F7、F52）被測出都含有甾體及三萜類化合物。根據(jù)結(jié)果推測，對(duì)無乳鏈球菌有顯著抑制作用的菌株可能含有甾體及三萜類物質(zhì)。結(jié)果為深入研究內(nèi)生真菌對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的抑制奠定基礎(chǔ)，也為生物防治羅非魚病害提供有益借鑒。

關(guān)鍵詞 ?海南粗榧;內(nèi)生真菌;羅非魚;無乳鏈球菌;抑菌活性;甾體及三萜類

中圖分類號(hào) ?R284 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi from

Cephalotaxus hainanensis Li to Streptococcus

agalactiae Isolated from Tilapia

YANG Huirong1， LIU Sixin1， LI Wu1， WU Yanchun1， HU Wenting2，

LIU Yihao1， HU Xiaoping1， LI Congfa1 *

1 College of Food， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Marine， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?Fungal cake and filter paper methods were used to determine the antimicrobial activity of 64 endophytic fungi from C. hainanensis Li to S. agalactiae isolated from tilapia， and the chemical composition of the active strains was also detected. The results showed that： by the fungal cake method， eleven of 64 strains had significant inhibiting effect on S. agalactiae， 17.2% of the total number of strains， and the inhibition zone diameter ranged from（8.7±0.3）mm to（16.2±0.2）mm. By the filter paper method， there were 12 strains showing significant inhibiting effect on S. agalactiae， which accounting for 18.8% of the total number of the strains. The inhibition zone diameter ranged from（8.7±0.3）mm to（28.2±0.4）mm. The highest activity strain tested by the fungal cake method was not the same with that of the filter paper method. ?However， the strains of the highest activity（B30 and F52）and the strains of higher activity（B14， B30， B32， F7）， which obtained by fungal cake and filter paper methods， were inclusive of steroids and triterpenoids. This paper laid the foundation for further research on the endophytic fungal inhibity activity on S. agalactiae， and also provided a useful reference to the biological control of tilapia disease.

Key words ?Cephalotaxus hainanensis Li; Endophytic fungi; Tilapia; Streptococcus agalactiae; Antimicrobial activity; Steroids and triterpenoids

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.022

中國羅非魚（Tilapia）的生產(chǎn)和出口均為世界第一，是中國最具國際競爭力的淡水養(yǎng)殖品種，也是中國南方水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)[1]。然而，由無乳鏈球菌（Streptococcus agalactia）、海豚鏈球菌（S. iniae）等引起的羅非魚病害，已成為目前羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大阻礙，每年給全世界包括中國造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。無乳鏈球菌也被稱作B群鏈球菌[3]，還是引起奶牛乳房炎的病因之一，同時(shí)也是免疫抑制人群、孕婦、新生兒等的重要病原菌[4]?？梢?，鏈球菌病不僅對(duì)漁業(yè)和畜牧業(yè)產(chǎn)生巨大危害，而且對(duì)食品安全和人類健康也構(gòu)成嚴(yán)重威脅[5]。

當(dāng)前，在羅非魚養(yǎng)殖中通常使用抗生素、化學(xué)藥物等對(duì)鏈球菌病進(jìn)行防治，但是存在較嚴(yán)重的停藥反彈現(xiàn)象，且存在病原菌耐藥性增強(qiáng)和魚體藥物殘留等明顯缺陷[6]，對(duì)人類健康產(chǎn)生安全隱患，同時(shí)也對(duì)生態(tài)環(huán)境造成不良影響。目前尚未找到對(duì)羅非魚鏈球菌病高效且安全的防治措施[7]，因此，對(duì)羅非魚鏈球菌病及對(duì)這些病原菌的相關(guān)研究尤為重要。近年來，研究者們熱衷于以中草藥對(duì)無乳鏈球菌、海豚鏈球菌的抗菌研究。吳穎瑞等[1]研究了153種中草藥對(duì)羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性。李一珊等[8]研究了黃連和五倍子的乙醇提取物對(duì)羅非魚源性鏈球菌生長曲線的影響。也有利用水產(chǎn)益生菌等開展的抑菌研究。植物內(nèi)生真菌在活性物質(zhì)種類和產(chǎn)量方面表現(xiàn)出巨大潛力，其合成的次生代謝產(chǎn)物不但化學(xué)成分豐富，而且具有多種多樣的生物活性，如抗腫瘤活性、抗病原微生物活性、抗病毒活性、酶抑制活性、免疫抑制活性和殺蟲活性等[9]，其中一些內(nèi)生真菌由于能產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[10]而研究熱度與日俱增，從中發(fā)現(xiàn)新化合物的報(bào)道也屢見不鮮[11]。海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li）及其內(nèi)生真菌是本實(shí)驗(yàn)室長期開展研究的方向之一，海南粗榧的多種組織中都能產(chǎn)生多種生物堿，其中三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿已被開發(fā)成抗白血病藥物[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，分離自海南粗榧樹皮的內(nèi)生真菌也能產(chǎn)生種類豐富的生物活性物質(zhì)[13]。中國南方地區(qū)的羅非魚病多由無乳鏈球菌所致[14]，而目前尚未見關(guān)于內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)羅非魚病抑菌作用的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以篩自海南省熱帶植物園、海南尖峰嶺和霸王嶺自然保護(hù)區(qū)的64株海南粗榧內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，研究其對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑制活性，為尋找內(nèi)生真菌來源的無乳鏈球菌抑制劑的深入研究奠定前期基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?海南粗榧內(nèi)生真菌 ? 64株內(nèi)生真菌篩選自海南省熱帶植物園、海南尖峰嶺自然保護(hù)區(qū)、霸王嶺自然保護(hù)區(qū)三地的海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li）樹皮、樹葉等組織，均保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 ?供試菌株 ? 羅非魚源無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae HYXY08），分離自羅非魚病魚，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 ?培養(yǎng)基 ? PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)液（BHIB）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA）參照文獻(xiàn)配制[13]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌餅法抑菌活性測試 ? 將保藏的內(nèi)生真菌在新鮮的PDA斜面上活化培養(yǎng)3～5 d，然后接種于PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)11 d后用于菌餅法活性測試。

將保藏的無乳鏈球菌HYXY08在新鮮的BHIA斜面上培養(yǎng)24 h，用BHIB洗下菌苔，充分渦旋搖勻，采用顯微計(jì)數(shù)法，將其稀釋為106 cfu/mL的菌懸液。取1 mL菌懸液混菌法制備無乳鏈球菌的檢測平板。

用Φ6 mm的滅菌打孔器制備每種內(nèi)生真菌的菌餅若干片，無菌接種于無乳鏈球菌的檢測平板上，每株內(nèi)生真菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，以未接種的PDA瓊脂餅片作陰性對(duì)照（CK-1）置于平板中央。28 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑，取平均值[15]。

1.2.2 ?濾紙片法抑菌活性測試 ? 將每株內(nèi)生真菌的斜面活化種子接種至300 mL PDB培養(yǎng)基中（1 L錐形瓶），每菌株3瓶平行，并設(shè)未接種的空白培養(yǎng)基作陰性對(duì)照（CK-2）。28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)11 d ，濾紙抽濾得到發(fā)酵上清液，以發(fā)酵液：乙酸乙酯=1 ∶ 1（V/V）超聲萃取，循環(huán)3次，減壓旋蒸、濃縮后得到代謝產(chǎn)物粗提物，4 ℃冷藏備用。

以丙酮溶解上述代謝產(chǎn)物粗提物、配成10 mg/mL的丙酮溶液，將其加到Φ6 mm的滅菌濾紙片上，每片加20 uL，風(fēng)干后擺放于無乳鏈球菌的檢測平板上，每樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。以純丙酮溶劑吸附的濾紙片做陰性對(duì)照置于平板中央。28 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑，取平均值[16]。

1.2.3 ?活性菌株代謝物初步測試 ? 根據(jù)待測樣品與所加指示試劑發(fā)生的沉淀或顏色反應(yīng)特征，初步推測其化學(xué)成分的種類。在試管中通過沉淀和顏色反應(yīng)測試生物堿、甾體及三萜類化合物、蒽醌及其苷類、黃酮及其苷類和皂甙類化合物;在濾紙片上進(jìn)行顏色反應(yīng)測試酚類和有機(jī)酸化合物[17]。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菌餅法抑菌活性測試

以菌餅法測試64株海南粗榧內(nèi)生真菌對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性（表1），結(jié)果表明，有明顯抑制作用的有11株，占總菌株的17.2%。抑菌效果最好的是分離自海南省熱帶植物園的B30菌株，抑菌圈為Φ（16.2±0.2）mm;抑菌效果相對(duì)較好的有F45、A13、B14、B6等菌株，樣品來自海南省熱帶植物園（代號(hào)A和B）、海南尖峰嶺自然保護(hù)區(qū)（代號(hào)C、D、E）和霸王嶺自然保護(hù)區(qū)（代號(hào)F）。

2.2 ?濾紙片法抑菌活性測試

濾紙片法的測定結(jié)果（表2）表明，64株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物乙酸乙酯粗提物中有12株對(duì)羅非魚無乳鏈球菌具有明顯抑制作用，占總數(shù)的18.8%。抑菌效果最好的是分離自霸王嶺自然保護(hù)區(qū)的F52菌株，抑菌圈為Φ（28.2±0.4）mm，相對(duì)較好的有B32、A21、B14、B30、D4、F7、F103、F39等菌株。其中2種方法都顯示抑菌較好的是B14、B30、B32、F7和F52等菌株。

2.3 ?活性菌株代謝產(chǎn)物的初步測試

對(duì)12株活性菌的代謝產(chǎn)物逐一進(jìn)行化學(xué)成分的初步測試，根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象（沉淀、顏色等）預(yù)測其所含化合物的種類，結(jié)果（表3）表明，含有甾體及三萜類和生物堿類代謝產(chǎn)物的菌株較為豐富，分別有8株和6株;含有皂苷類的菌株有5株;含酚類和蒽醌及其苷類的均為4株;含黃酮及其苷類和有機(jī)酸較少，分別只有3株和2株。其中D4只顯示含皂苷類化合物，F(xiàn)39只顯示含生物堿，而A21顯示含有4類化合物，F(xiàn)127顯示含有6類化合物，這說明海南粗榧內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類多樣。其中菌餅法高活性菌株B30含有甾體及三萜類、酚類和生物堿類化合物;濾紙片法高活性菌株F52含有甾體及三萜類、蒽醌及其苷類和皂苷類物質(zhì)，顯示2菌共有的成分是甾體及三萜類化合物，而2種方法均顯示較高活性的菌株B14、B30、B32和F7、F52中，都測試到含有甾體及三萜類。

3 ?討論與結(jié)論

當(dāng)今，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。人們從內(nèi)生真菌中分離到很多活性物質(zhì)，如Zheng等[18]從人參的內(nèi)生真菌分離出2個(gè)新化合物和6個(gè)已知化合物，其中化合物brefeldin A對(duì)MKN45、LoVo、A549、MDA-MB-435、HepG2和HL-60等6株癌細(xì)胞表現(xiàn)出極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其IC50<0.12 μg/mL，化合物ginsenocin和penicillic acid對(duì)這6株癌細(xì)胞也表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，其IC50在0.49～7.46 μg/mL之間。Ferdinand等[19]從可可樹的一株內(nèi)生真菌分離出3種新的聚酮類化合物，它們對(duì)腐霉、絲囊霉和紋枯病有極強(qiáng)的抑制作用。Hidayat等[20]從內(nèi)生真菌中分離出3個(gè)已知化合物和3個(gè)新化合物，其中colletonoic acid表現(xiàn)出很好的抑制細(xì)菌、真菌和藻類的活性。本實(shí)驗(yàn)室長期開展的海南粗榧內(nèi)生真菌研究顯示其抑菌、抗癌活性高，次級(jí)代謝產(chǎn)物種類豐富，而對(duì)病原菌的抑菌作用機(jī)制尚不夠清楚，通常起作用的產(chǎn)物成分之間可能存在協(xié)同機(jī)制。本研究結(jié)果顯示：菌餅法和濾紙片法分別有11株和12株對(duì)無乳鏈球菌具有明顯抑制作用;這些內(nèi)生真菌對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的抑菌代謝產(chǎn)物種類比較豐富多樣，但對(duì)無乳鏈球菌有顯著拮抗作用的菌株都含有甾體及三萜類化合物。而本研究所用菌餅法和濾紙片法所測得的最高活性菌株以及抑菌的作用不一致。這種現(xiàn)象可能的原因有：（1）2種方法培菌方法不同，內(nèi)生菌所能合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類和濃度可能不同;（2）2種方法所能測試的抑菌物質(zhì)濃度不同，紙片法是乙酸乙酯提取、濃縮后所測，其抑菌圈顯然也大，因此推測菌餅法中的高活性菌株（如B30、F45、B14等）可能具有較強(qiáng)的抑菌物質(zhì)合成能力，且能分泌到胞外。

本研究結(jié)果將為深入研究內(nèi)生真菌對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的拮抗作用奠定了基礎(chǔ)，也為生物防治羅非魚無乳鏈球菌病提供有益借鑒。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳穎瑞， 龔慶芳， 方 ?宏， 等. 153種中草藥對(duì)羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 41（1）： 25-31.

[2] Ye X， Li J， Lu M， et al. Identification and molecular typing of Streptococcus agalactiae isolated from pond-cultured tilapia in China[J]. Fisheries Science， 2011， 77： 623-632.

[3] Evans J J， Pasnik D J， Klesius P H， et al. First report of Streptococcus agalactiae and Lactococcus garvieae from a wild bottlenose dolphin（Tursiops truncatus）[J]. J Wildl Dis， 2006， 42（3）： 561-569.

[4] Heath P T. An update on vaccination against group B streptococcus[J]. Expert Rev Vaccines， 2011， 10（5）： 685-694.

[5] 趙光軍， 周永燦， 楊 ?慧. 羅非魚無乳鏈球菌拮抗菌的分離、 鑒定及多樣性分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 4（5）： 312-319.

[6] Pandiyan Priyadarshini， Balaraman Deivasigamani， Thirunavukkarasu Rajasekar， et al. Probiotic in aquaculture[J]. Drug Invention Today， 2013， 5（1）： 55-59.

[7] ZHang D， Li A， Guo Y， et al. Molecular characterization of Streptococcus agalactiae in diseased farmed tilapia in China[J].Aquaculture， 2013， 412： 64-69.

[8] 李一珊， 倪 ?晨， 童建輝， 等. 黃連、 五倍子醇提物對(duì)羅非魚源性鏈球菌生長曲線的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2013， 6（19）： 234-237.

[9] 陳基萍. 瘋草內(nèi)生真菌種屬鑒定及次生代謝產(chǎn)物研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2012.

[10] Guo L， Hyde K， Liew E. Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and Rdna sequences[J]. New Phytologist， 2000， 147（3）： 617-630.

[11] Hussain H， Ahmed I， Schulz B， et al. Pyrenocines J-M： Four new pyrenocines from the endophytic fungus， Phomopsis sp[J]. Fitoterapia， 2012， 83： 523-526.

[12] Lu D Y， Cao J Y， Xu B. Biological activities and clinical utilizations of harringtonine and homoharringtonine[J]. Atural Product Research and Development， 2000， 12（5）： 70-72.

[13] 吳延春. 海南粗榧內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌活性研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2012.

[14] 陳 ?賀. 羅非魚源無乳鏈球菌滅活疫苗的研制及其免疫效果的研究[D]. 湛江： 廣東海洋大學(xué)， 2012.

[15] 林愛玉， 邢曉科， 郭順星， 等. 四種藥用半紅樹植物內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2006， 41（12）： 892-894.

[16] Surendra K， Gond·Ashish Mishra·Vijay K， Sharma·Satish K， et al. Diversity and antimicrobial activity of endophytic fungi isolated from Nyctanthes arbor-tristis， a well-known medicinal plant of India[J]. Mycoscience， 2012， 53： 113-121.

[17] 肖崇厚. 中藥化學(xué)[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 2002.

[18] Zheng C J， Xu L L， Li Y Y， et al. Cytotoxic metabolites from the cultures of endophytic fungi from Panax ginseng[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2013， 97： 7 617-7 625.

[19] Ferdinand Mouafo Talontsi， Birger Dittrich， Anja Schüffler， et al. Epicoccolides： Antimicrobial and Antifungal Polyketides from an Endophytic Fungus Epicoccum sp. Associated with Theobroma cacao[J]. European Journal of Organic Chemistry， 2013， 15： 3 174-3 180.

[20] Hidayat Hussain， Natalia Root， Farah Jabeen. Seimatoric acid and colletonoic acid： Two new compounds from the endophytic fungi， Seimatosporium sp. and Colletotrichum sp.[J]. Chinese Chemical Letters， 2014， 25： 1 577-1 579.