殷 茵，劉 溯，王 芳，朱學(xué)亮，周邦信, 駱學(xué)農(nóng)

單增李斯特菌P60單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

殷 茵1,2，劉 溯3，王 芳2，朱學(xué)亮2，周邦信2, 駱學(xué)農(nóng)2

目的 制備并篩選單增李斯特菌P60特異性單克隆抗體，初步建立其快速檢測(cè)方法。方法 以體外表達(dá)并純化的李斯特菌P60蛋白為抗原免疫Balb/c 小鼠, 采用雜交瘤技術(shù)制備抗李斯特菌P60的McAb，鑒定其抗體亞型，并對(duì)單抗的腹水效價(jià)、穩(wěn)定性及親和力進(jìn)行分析。用純化的單克隆抗體包被酶標(biāo)板，結(jié)合生物素化處理的P60多克隆抗體，夾心ELISA篩選單增李斯特菌特異性單抗，并以重組P60為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果 獲得了4株可穩(wěn)定分泌P60單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。ELISA檢測(cè)表明，篩選的6C2單克隆抗體株可特異性與單增李斯特菌(4b)P60反應(yīng)。結(jié)論 建立的夾心ELISA方法可對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行特異性鑒別和定量檢測(cè)。

單增李斯特菌；P60；單克隆抗體；鑒定；ELISA

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM) 簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種能引起人獸共患的食源性致病菌。該菌屬于細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性桿菌，人畜感染后，主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和血液中單核細(xì)胞增多等癥狀，死亡率達(dá)20%～30%[1]。該菌在自然界廣泛存在，食品中存在的單增李斯特菌對(duì)人類安全構(gòu)成很大威脅，是21世紀(jì)對(duì)人類健康具有重大影響的12種病原微生物之一[2]。

李斯特菌包括單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、無害李斯特菌(L.innocua)、威氏李斯特菌(L.welshimeri)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri)。除L.M對(duì)人畜致病性高外，其它的都致病力很小或無致病力，而且在自然界中普遍存在。因此，如何區(qū)分食品污染的是致病性李斯特菌還是其它常在李斯特菌，是食品工業(yè)或動(dòng)物李斯特菌病免疫學(xué)診斷的首要課題。目前，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法要經(jīng)過增菌、細(xì)菌分離以及生化鑒定等過程，因而所需時(shí)間較長(zhǎng)，花費(fèi)人力物力較大，不適合快速檢測(cè)的需要。分子檢測(cè)技術(shù)如PCR、基因探針等分子生物學(xué)方法[3-4]，需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器, 而且特異性差。 因此，不適合在現(xiàn)場(chǎng)對(duì)大量樣品進(jìn)行快速檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)單增李斯特菌單克隆抗體的制備以及ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了很多研究，但這些研究大都以ActA、LLO等為研究對(duì)象。鑒于P60蛋白與李斯特菌侵襲性、免疫原性和種屬分類密切相關(guān)。本研究以原核表達(dá)的重組P60蛋白為免疫原，制備并篩選出了單增李斯特菌特異性單克隆抗體，初步建立了基于P60的夾心ELISA方法，用于食品及動(dòng)物產(chǎn)品中單增李斯特菌的特異性檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 菌株和細(xì)胞 單增李斯特菌(ATCC 19115，19117) 、綿羊李斯特菌(ATCC 19119)、無害李斯特菌(ATCC 51742)、塞氏李斯特菌(ATCC 35967)、維氏李斯特菌(ATCC 35897)均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection)即ATCC公司。重組菌株pET-p60/BL21由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室液氮保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c純系雄性小鼠購(gòu)自蘭州生物制品研究所，鼠齡6～8周，體重18～22 g，用于免疫和制備飼養(yǎng)細(xì)胞；5月齡雌鼠用于制備腹水。

1.3 主要試劑 鎳瓊脂糖凝膠FF蛋白純化回收試劑(北京韋氏博慧)、改良型RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hy Clone)、HAT、HT、聚乙二醇( PEG 1500 )、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma)，小鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒(Iso Strip)、羊抗鼠IgG-HRP(北京博奧森)、HiTrapTMProtein G HP Columns (GE)。生物素N羥基丁二酰亞胺脂(BNHS)、二甲基甲酰氨(DMF)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素(Sigma)。

1.4 免疫抗原的制備 將攜帶pET-p60質(zhì)粒的BL21重組菌株37 ℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1.0%接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃劇烈振搖3～4 h，加IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)4～5 h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心收集菌體，反復(fù)凍融及超聲波處理后收集上清，用鎳瓊脂糖凝膠FF純化回收目的蛋白。SDS-PAGE分析重組P60蛋白的純化效果，用Thermo Scientific NanoDrop 2000測(cè)定蛋白濃度。

1.5 Balb/ c小鼠的免疫與細(xì)胞融合 首次免疫用純化的P60蛋白100 μg加等量弗氏完全佐劑，混勻制成乳劑，皮下注射6～8周齡雌性Balb/c小鼠。此后改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，隔21 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫。于融合前3 d，經(jīng)小鼠腳掌肌肉進(jìn)行加強(qiáng)免疫。斷尾采血，用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠脾細(xì)胞(1∶10)在500 μg/L PEG介導(dǎo)下進(jìn)行融合。加入含有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)的RPMI 1640選擇性培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2周后換次黃嘌呤2胸腺嘧啶核苷(HT)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 雜交瘤細(xì)胞的克隆與亞型鑒定 將HT培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底1/ 4～1/ 3 時(shí)，用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，選擇陽性值高的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行再克隆，直至陽性率達(dá)到100 %。間接ELISA操作步驟如下：用P60抗原包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜。按100 μL/孔加入雜交瘤培養(yǎng)上清液，37 ℃反應(yīng)1 h ，洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，洗滌3 次，再加入底物( OPD) 顯色，每孔100 μL，并用2 mol/L H2SO4終止，每孔50 μL，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD490 nm值。陰性對(duì)照孔為1∶200的正常Balb/c小鼠血清，陽性對(duì)照孔為1∶200的免疫小鼠血清。

取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型及亞型。

1.7 單克隆抗體腹水的制備與效價(jià)測(cè)定 Balb/c小鼠腹腔注射0. 5 mL液體石蠟(高壓滅菌)，7～10 d 后腹腔注入1×106～5×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。注射后7～10 d ，可見小鼠腹部明顯膨大，無菌操作采集腹水，1 000 r/ min離心10 min，棄去最上層的脂肪層，收集中間液體層，即為單克隆抗體腹水。 用重組P60抗原包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜，將粗制腹水10倍系列稀釋(1∶10～1∶109)，采用間接EL ISA 測(cè)定抗體效價(jià)。

1.8 單克隆抗體的物理性質(zhì)分析 用P60抗原包被酶標(biāo)板，將腹水按不同比例稀釋，用間接ELISA以進(jìn)行腹水親和力測(cè)定。根據(jù)下列公式計(jì)算單克隆抗體的親和常數(shù)[10]：

AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100%

上式中A1表示第1 株單抗的OD 490值；A2表示第2株單抗的OD 490值；A1+2表示2 株單抗兩兩疊加后的OD 490值。

取粗制腹水用pH 7.2的PBS做1∶1 000稀釋，置56 ℃水浴中4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h，分別用ELISA檢測(cè)其OD值的變化，分析單克隆抗體的熱穩(wěn)定性；同時(shí)以pH 2.2的鹽酸和pH9.6的碳酸鹽緩沖液分別對(duì)腹水做1∶10稀釋，評(píng)價(jià)單抗對(duì)酸堿的穩(wěn)定性。

采用飽和硫酸銨沉淀法結(jié)合HiTrapTMProtein G HP Columns純化腹水，進(jìn)行SDS-PAGE分析，Thermo Scientific NanoDrop 2000測(cè)定純化后腹水的濃度。

1.9 生物素化多克隆抗體的制備 用純化的P60蛋白免疫家兔，制備P60多克隆抗體。將多抗用飽和硫酸銨沉淀，然后用蛋白G柱進(jìn)行純化，測(cè)定蛋白含量。用DMF將BNHS配成1 mg/mL溶液，再用0.1 mol/L pH9.0的NaHCO3將多抗稀釋至1 mg/mL，按BNHS∶IgG體積比1∶8～1∶15震蕩混勻10 min，室溫靜置3～4 h，將混合物裝入透析袋中4 ℃透析過夜，加入等體積甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 夾心ELISA檢測(cè)方法的初步建立 分別用100 μL的2E4、3H5和6C2(5F8單抗效價(jià)太低)單抗包被酶標(biāo)板。將L.monocytogenes、L.ivanovii、L.innocua、L.welshimeri和L.seeligeri分別接種BH培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)后離心收集上清作為待檢樣品，分別取100 μL加入已用單抗包被的酶標(biāo)板中，再加入生物素化的P60多抗，室溫溫育30 min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親合素(Streptavidin)，室溫溫育30 min。加入TMB底物溶液顯色，測(cè)定OD450nm的值。根據(jù)OD450 nm的值確定僅與L.monocytogenes反應(yīng)的單抗株。用篩選確定的L.monocytogenes特異性單抗包被酶標(biāo)板，用純化的重組P60作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2 000 pg/mL)，倍比稀釋后每孔100 μL分別加入酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，再加入生物素化的P60多抗，室溫溫育30 min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin，室溫溫育后加入TMB底物溶液顯色，測(cè)定OD450 nm的值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)OD450 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)夾心ELISA所測(cè)得的OD450 nm值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算所測(cè)樣品中P60蛋白的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 抗原制備 將表達(dá)菌體裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，大約在46 ku的位置有一條濃染的蛋白條帶，與預(yù)期分子量一致；鎳瓊脂糖凝膠FF純化后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示(圖1)，在46 ku處有單一蛋白帶，表明目的蛋白獲得了較好的純化效果。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；2:純化后的重組蛋白：

M: Protein marker; 1: pET-P60/BL21 induced by IPTG; 2: Purified recombinant protein.

圖1 P60重組抗原的SDS-PAGE分析

Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombined p60 protein

圖2 抗P60單克隆抗體的亞型鑒定

2.2 單克隆抗體亞型鑒定與效價(jià)測(cè)定 經(jīng)細(xì)胞融合與克隆篩選，共獲得4株P(guān)60單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，分別為2E4、5F8、3H5和6C2。其中2E4、5F8和6C2為IgG1亞型，3H5為IgG2a亞型。ELISA測(cè)定2E4的腹水效價(jià)為1∶104，3H5為1∶104，5F8為1∶103，6C2為1∶106(圖2)。

2.3 單克隆抗體物理性質(zhì)分析 經(jīng)測(cè)定腹水中McAb與包被抗原反應(yīng)的飽和濃度，2E4和3H5均為10-3，5F8為10-2，6C2為10-5。根據(jù)McAb飽和度，用間接ELISA法相加試驗(yàn)進(jìn)行4株單抗識(shí)別的抗原表位分析，檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 4株單抗識(shí)別抗原表位的分析

注：未標(biāo)注星號(hào)為每株單抗的OD 490值，標(biāo)星號(hào)的為2株單抗兩兩疊加后的OD 490值

Note: Without asterisk numbers represent the value of OD490 for each McAb. The numbers marked with asterisk refer to accumulated value of two McAb.

根據(jù)表中數(shù)據(jù)計(jì)算的AI值表明，2E4與3H5識(shí)別相同的抗原表位，2E4與5F8識(shí)別相同的抗原表位；2E4與6C2識(shí)別相同的抗原表位；3H5與5F8識(shí)別相同的抗原表位；3H5與6C2識(shí)別相同的抗原表位；5F8與6C2識(shí)別相同的抗原表位。

4株雜交瘤細(xì)胞株的腹水的穩(wěn)定性均不受熱和堿的影響，但均受酸的影響。

2.4 單克隆抗體腹水純化與濃度測(cè)定 純化前后單克隆抗體腹水的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3。2E4、3H5和6C2的濃度分別是1.039 mg/ mL，1.190 mg/ mL和5.688 mg/ mL。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:2E4腹水；2:純化后的2E4蛋白；3:3H5腹水；4:純化后3H5蛋白；5:5F8腹水；6:純化后5F8蛋白；7:6C2腹水；8:純化后6C2蛋白

M : Protein marker; 1 : 2E4 ascites; 2 : Purified 2E4 protein; 3 : 3H5 ascites; 4: Purified 3H5 protein; 5: 5F8ascites; 6: Purified 5F8 protein; 7: 6C2 ascites; 8 : Purified 6C2 protein.

圖3 單克隆抗體腹水SDS-PAGE電泳分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of the McAbs ascites

2.5 夾心ELISA的初步建立 不同單抗與李斯特菌屬不同成員培養(yǎng)上清的夾心ELISA反應(yīng)結(jié)果表明，三株單抗6C2、3H5和2E4與單增李斯特菌LM4b反應(yīng)的OD450 nm在0.2以上，而單抗株6C2與其余菌株培養(yǎng)上清反應(yīng)的OD450 nm均在0.1以下(圖4所示)。說明根據(jù)6C2單抗與李斯特菌反應(yīng)的OD450 nm大小可以區(qū)分致病菌(單增李斯特菌)與非致病菌。用重組P60為標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋后包被酶標(biāo)板，以生物素標(biāo)記的P60多抗和6C2單抗建立的夾心ELISA，測(cè)定不同濃度P60所對(duì)應(yīng)的OD450 nm。結(jié)果以P60濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450 nm為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.992 2)如圖5所示，基本呈一條直線。說明待檢樣品的OD450nm值與待測(cè)樣品中P60濃度成正比，可通過建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待檢樣品進(jìn)行定量分析。

單增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)、綿羊李斯特菌(L.ivanovii, LIV)、無害李斯特菌(L.innocua, LIN)、威氏李斯特菌(L.welshimeri, LW)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri, LS)

圖4 四株單抗與李斯特菌屬不同菌株培養(yǎng)上清的夾心ELISA反應(yīng)

Fig.4 OD value of ELISA of four McAb reacted with culture supernatant from Listeria

圖5 不同濃度P60與夾心ELISA光密度(OD)值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.5 Plotting P60 standards against the corresponding of the value of OD450

3 討 論

Boerlin[5]等學(xué)者用重組的LLO和inl A作為ELISA診斷抗原檢測(cè)牛的L.monocytogenes抗體。結(jié)果敏感性特異性分別達(dá)82%和92%，說明用基因工程生產(chǎn)的抗原建立的ELISA方法可用于L.monocytogenes的診斷和檢測(cè)。Vazquez- Boland[6]等用純化的重組溶血素蛋白包被聚苯乙烯板，利用間接ELISA 方法，成功檢測(cè)出了綿羊感染的L.monocytogenes。崔煥忠[7]等以致病性李斯特菌ActA蛋白為研究對(duì)象，原核表達(dá)了ActA 蛋白，制備了抗ActA 特異性單克隆抗體，并從中篩選2株單克隆抗體，分別用于免疫膠體金標(biāo)記和膠體金試紙檢測(cè)線的包被，從而研制成了檢測(cè)L.monocytogenes的膠體金試紙條。秦玉敏[8]用純化的重組LLO蛋白免疫小鼠，獲得6株穩(wěn)定分泌抗LLO單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以制備的腹水單抗為診斷抗體，分別與BHI培養(yǎng)基和TSB-YE培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同時(shí)段的L.monocytogenes上清發(fā)生反應(yīng)，建立了檢測(cè)L.monocytogenes的阻斷ELISA方法。但這些方法只能用于L.monocytogenes的定性檢測(cè)，而且容易出現(xiàn)假陽性。因?yàn)槠渌侵虏⌒岳钏固鼐部赡艹尸F(xiàn)陽性反應(yīng)。因此，進(jìn)行致病性和非致病性李斯特菌的鑒別診斷或檢測(cè)是非常重要的。

李斯特菌P60蛋白是由入侵相關(guān)蛋白(invasion-associated protein,iap)基因編碼的分子量為60 ku的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞分裂中非常重要的具有免疫原性的胞壁質(zhì)水解酶(murein hydrolase)，可大量分泌于培養(yǎng)介質(zhì)中。因此，P60是開發(fā)單增李斯特菌免疫學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的理想靶標(biāo)。Yu等[9]篩選了兩株P(guān)60單克隆抗體p6007和p6017，分別特異性識(shí)別單增李斯特菌和李斯特菌屬的P60蛋白。利用兩株單抗結(jié)合P60多克隆抗體，建立了能特異性鑒別單增李斯特菌的夾心ELISA方法。與上述研究相比，本研究用重組蛋白P60抗原免疫小鼠，獲得了4株穩(wěn)定性較高的單克隆抗體，并從中篩選出了能特異性識(shí)別單增李斯特菌P60的單抗。制備重組P60的多克隆抗體，并將其進(jìn)行生物素化處理，利用生物素(Biotin)-親合素(Avidin)放大系統(tǒng)，大大提高了夾心ELISA檢測(cè)的敏感性。同時(shí)，通過用重組P60蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品培養(yǎng)物中P60蛋白的定量檢測(cè)。上述研究結(jié)果將為建立基于6C2單克隆抗體的夾心ELISA方法，用于單增李斯特菌病的鑒別診斷和食品單增李斯特菌污染的定量檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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Luo Xue-nong, Email: luoxuenong@caas.cn

Monoclonal antibodies againstListeriamonocytogenes

YIN Yin1,2,LIU Su3,WANG Fang2,ZHU Xue-liang2,ZHOU Bang-xin2,LUO Xue-nong2

(1.TianjinCenterForAnimalDiseaseControlandPrevention,Tianjin300402,China; 2.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,CAAS,Lanzhou730046,China; 3.LanzhouInstituteofBiologicalProducts,Lanzhou730046,China)

The aim of this study was to prepare monoclonal antibodies against P60 and develop a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, which would be used in the detection ofListeriamonocytogenes. The purified recombinant protein of P60, produced by prokaryotic expression, was used to immunize the Balb/c mice. The hybridoma cell lines against P60 were obtained by fusing spleen cells from the immunized mice with mouse Sp2/0 myeloma cells. Specific McAb againstL.monocytogeneswas screened by ELISA. The isotype of the McAb was identified, and then the titers, stability and the affinity of ascites were analyzed. Sandwich ELISA was established using purified ascites and biotinylated P60 polyclonal antibody to detect the p60, which obtained from supernatant ofListeriacultures. The standard curve was established for quantitative determination using the recombinant P60 as the standard against the corresponding the value of OD450. Results showed that 6C2 McAb could be recognized specifically byL.monocytogenes, and the ELISA method based on 6C2 McAb could be used in identification and quantitative detection of samples contaminated withL.monocytogenes.

Listeriamonocytogenes; P60; monoclonal antibodies; identification; ELISA

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007BAD40B01)

駱學(xué)農(nóng)，Email:luoxuenong@caas.cn

1．天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046 3.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司， 蘭州 730046

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10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.007

R378.99

A

1002-2694(2015)06-0527-05

2014-12-16；

2015-03-30