徐 艷,張秀國,黃國強(qiáng),張 琴,楊家林,孫雪萍,*

(1.西海洋研究所,海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西北海 536000;2.北京航空航天大學(xué)北海學(xué)院,廣西北海 536000)

毛蚶抗菌活性篩選及低極性組分GC-MS分析

徐 艷1,張秀國2,黃國強(qiáng)1,張 琴1,楊家林1,孫雪萍1,*

(1.西海洋研究所,海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西北海 536000;2.北京航空航天大學(xué)北海學(xué)院,廣西北海 536000)

目的:研究毛蚶的抗菌活性部位及有效成分。方法:毛蚶軟組織經(jīng)乙醇提取后,采用液液萃取法將提取物分為石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相4個(gè)不同的極性部位;采用抑菌圈法和最小殺菌濃度測(cè)定法,對(duì)毛蚶乙醇提取物和各極性部位進(jìn)行了抗菌活性測(cè)定,并用正相硅膠柱對(duì)抗菌活性較好的石油醚相進(jìn)行了分離純化,得到甾體組分;采用GC-MS技術(shù)對(duì)石油醚相和甾體組分進(jìn)行了化學(xué)成分分析。結(jié)果:毛蚶石油醚相的抑菌效果最好;從毛蚶石油醚相中鑒定出了30個(gè)化合物,主要為脂肪類和甾醇類化合物;從甾體組分中鑒定出8個(gè)化合物,其中7個(gè)為首次從毛蚶中分離鑒定。結(jié)論:毛蚶的石油醚相具有明顯的抗菌活性,石油醚相以甾醇類化合物為主。

毛蚶,抗菌活性,氣相色譜-質(zhì)譜法,甾醇

毛蚶(ScapharcasubcrenataLischke)是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)埋棲型貝類,為蚶科動(dòng)物,產(chǎn)于我國南北沿海,藥用歷史悠久,《神農(nóng)本草經(jīng)》及歷代主要本草中均有記載,其以殼入藥,名瓦楞子,具有消痰化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、制酸止痛功效[1-2]。蚶肉為海產(chǎn)食品,據(jù)《隨息居飲食譜》記載,能“補(bǔ)血、潤腸、生津、健胃”,民間用于抗腫瘤、抗貧血和抗炎等,有很好的藥用和保健價(jià)值。

目前國內(nèi)對(duì)毛蚶的研究多集中于生化性質(zhì)、營養(yǎng)和養(yǎng)殖方面,以粗提取物和營養(yǎng)成分分析為主[3],而對(duì)其小分子活性物質(zhì)的分離純化和鑒定較少。對(duì)毛蚶活性成分的研究多為毛蚶多糖、多肽這兩類大分子物質(zhì),活性主要集中在抗腫瘤、抗氧化、免疫活性和抗菌活性等方面[4-6]。郭道森等[7]對(duì)毛蚶血漿中抗菌蛋白進(jìn)行了純化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所得抗菌蛋白具有選擇性抑菌活性;胡顯鏡、陳莉莉和宋麗艷等[8-9]對(duì)毛蚶活性多肽的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了研究;何赟綿等[10]從毛蚶中分離純化了一個(gè)新的糖肽類化合物,具有免疫活性,且其活性與糖側(cè)鏈密切相關(guān);孫雪萍等[11]從毛蚶中分離鑒定了4個(gè)單體化合物,分別為:5-烯-膽甾醇、膽甾醇、3-酮-20-烯孕甾烷和3-羧基-吲哚;徐艷等[12]對(duì)毛蚶進(jìn)行了抗鹵蟲活性檢測(cè),結(jié)果顯示,毛蚶的乙酸乙酯相和石油醚相的抗鹵蟲活性明顯,其中甾醇類化合物是有效的抗鹵蟲活性成分。

本工作擬對(duì)毛蚶的醇提物以及不同極性部位進(jìn)行抗菌活性檢測(cè),研究毛蚶對(duì)9種致病菌的抑制活性,并應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)其活性部位進(jìn)行化學(xué)成分分析,為進(jìn)一步研究其生物活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛蚶(S.subcrenata) 采自廣西北海;7株人體致病菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、四聯(lián)球菌(Micrococcustetragenus)和藤黃八疊球菌(Micrococcusluteus),2株海洋致病菌:副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum) 均為海南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院鄭彩娟老師贈(zèng)送;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

NE-1101v旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社;SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;EZ 2.3蒸發(fā)工作站 英國GeneVac公司;ML 204/02電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HC-300T2高速多功能粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司;Thermo Trace GC Ultra-DSQII氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國塞默飛世爾科技公司;200～300目正相硅膠、GF254薄層層析板 青島海洋化工有限公司;Hirayama HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 購自廣州市深華生物技術(shù)有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 購自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試樣品的制備 鮮毛蚶(15kg)洗凈、去殼、取肉,于組織搗碎機(jī)中勻漿,經(jīng)95%乙醇浸泡提取4次,每次1h,減壓濃縮提取液得浸膏71.2g,浸膏用水混懸后,分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,減壓濃縮后得到石油醚相(38.5g),乙酸乙酯相(13.5g),正丁醇相(17.3g)和水相(414.0g)。乙醇提取物和4個(gè)極性部位室溫放置備用。

石油醚相浸膏經(jīng)正相硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯(石油醚∶乙酸乙酯=20∶1)梯度洗脫,收集組分,濃縮并重結(jié)晶后得到白色固體(3.7g),薄層層析和1H-NMR譜顯示,此白色固體為甾醇組分,進(jìn)一步的柱層析分離未能獲得單體化合物,故運(yùn)用GC-MS法對(duì)該組分進(jìn)行分析。

1.2.2 抑菌活性檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行培養(yǎng)基的制備,試管稀釋法采用液體LB培養(yǎng)基;抑菌圈(DIZ:Diameter of inhitition zone,mm)和最小殺菌濃度(MBC:minimum bactericidal concentration,mg/mL)的測(cè)定選用LB平板。

初篩采用紙片擴(kuò)散法(disk-diffusion method)[14],檢測(cè)毛蚶乙醇提取物和4個(gè)極性部位對(duì)所有供試菌株的抗菌活性,全部操作均為無菌操作,實(shí)驗(yàn)為單濃度三次重復(fù)。采用試管稀釋法(Tube dilution method)[15]測(cè)定了初篩有活性的樣品的最小殺菌濃度。

1.2.3 石油醚相的甲酯化 用氫氧化鉀-甲醇甲酯化法[16]對(duì)毛蚶石油醚相進(jìn)行脂肪酸甲酯化,加入正己烷進(jìn)行脂肪酸甲酯的萃取。靜置分層后,取上層有機(jī)相(正己烷)適當(dāng)稀釋,用針筒式微孔濾膜過濾器過濾后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)樣分析。

1.2.4 GC-MS分析條件 氣相色譜條件:色譜柱為VF-5MS石英毛細(xì)柱(30mm×0.25mm×0.25μm);MS條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量70eV,操作系統(tǒng)Xcalibur,譜庫NIST02;石油醚相GC-MS分析參數(shù)為:初始溫度50℃,保持2min,程序升溫至130℃,速度5℃/min,再以25℃/min升至300℃;石油醚相甾體組分升溫程序:初始溫度:160℃,程序升溫至260℃,速度:10℃/min,再以5℃/min 升至300℃,保持10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性

毛蚶軟體組織的乙醇提取物和4個(gè)極性部位對(duì)供試菌的抑制作用不同,毛蚶石油醚相對(duì)6株供試菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用,其中有4株致病菌(大腸桿菌、白色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、藤黃八疊球菌)和2株海洋致病菌(副溶血弧菌和鰻弧菌),抑菌圈直徑約為6.5mm,而對(duì)其余3株致病菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和四聯(lián)球菌)沒有明顯抑制作用;毛蚶乙酸乙酯相只對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用;毛蚶乙醇總提物、正丁醇相和水相對(duì)所有供試菌均無抑制活性。見表1。

將毛蚶石油醚相和乙酸乙酯相進(jìn)行最小殺菌濃度檢測(cè),結(jié)果顯示,毛蚶石油醚相對(duì)白葡萄球菌(S.albus)的最小殺菌濃度為50mg/mL,對(duì)藤黃八疊球菌(M.luteus)的最小殺菌濃度為100mg/mL,而對(duì)大腸桿菌(E.coli)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、副溶血弧菌(V.prarhaemolyticus)和鰻弧菌(V.anguillarum)的最小殺菌濃度均大于100mg/mL;毛蚶乙酸乙酯相對(duì)大腸桿菌(E.coli)的最小殺菌濃度大于100mg/mL,詳見表2。

表1 毛蚶乙醇提取物及各相的抗菌活性Table 1 The antimicrobial activity of the ethanolic extract and fractions from S. subcrenata

注:抑菌圈直徑以平均值表示;“-”表示無活性。

表2 毛蚶石油醚相和乙酸乙酯相的最小殺菌濃度Table 2 Minimum bactericidal concentration of petroleum ether and ethyl acetate fraction from S. subcrenata

注:“>100”表示最小殺菌濃度大于100mg/mL;“/”表示未測(cè)。2.2 化學(xué)成分分析

2.2.1 石油醚相的化學(xué)成分分析 為了探討毛蚶石油醚相的化學(xué)組成,本文對(duì)其進(jìn)行了GC-MS分析,毛蚶石油醚相經(jīng)甲酯化處理后用GC-MS聯(lián)用儀分析,得到毛蚶石油醚相總離子流譜(見圖1),對(duì)各峰通過Xcalibur工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索,共鑒定出30個(gè)化合物(見表3)。石油醚相主要為低級(jí)性化合物,脂肪酸脂類化合物最多(14個(gè)),以不飽和脂肪酸為主(10個(gè)),還有較多的甾醇類化合物(10個(gè)),以膽甾醇為主,以及少量長(zhǎng)鏈烷烴(6個(gè)),詳見表3。

圖1 毛蚶石油醚相氣質(zhì)分析總離子流圖Fig.1 Total ion current(TIC)chromatogram of petroleum ether fraction from S. subcrenata

2.2.2 甾體組分的化學(xué)成分分析 為了進(jìn)一步分析石油醚相甾醇組分的化學(xué)組成,本文運(yùn)用GC-MS法對(duì)該組分進(jìn)行了分析,共鑒定出8個(gè)甾醇類化合物(見表4),占甾體粗晶總質(zhì)量的93.88%,包括膽甾(74.33%)、麥角甾(15.12%)、豆甾(4.17%)和雄甾(0.26%)4種類型。膽甾類化合物有3個(gè),以膽甾醇為主,占甾醇組分總質(zhì)量的53.06%,其次是膽甾-5,22-二烯-3β-醇和脫氫膽甾醇,各占甾醇組分總質(zhì)量的20.47%和0.8%;麥角甾類化合物也有3個(gè),分別為:麥角甾-5,22-二烯-3β-醇、麥角甾-7,22-二烯-3β-醇和(22Z)-26,27-二降-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇,占甾體組分總質(zhì)量的比例分別為:11.59%、2.44%和1.09%;另外,還有豆甾和雄甾類化合物各1個(gè),分別為豆甾-5-烯-3β-醇和雄甾-5-烯-3β-醇,分別占甾體組分總質(zhì)量的4.17%和0.26%。

3 結(jié)論

毛蚶的抑菌活性檢測(cè)結(jié)果顯示,石油醚相的抑菌效果較弱,但對(duì)白色葡萄球菌的抑制作用較明顯,最小殺菌濃度為50mg/mL;乙酸乙酯相僅對(duì)一株菌有微弱的抑制活性;乙醇浸膏、正丁醇相和水相都沒有抑菌活性,抑菌圈和最小殺菌濃度檢測(cè)結(jié)果具有一致性。具有抑菌活性的物質(zhì)主要集中在極性較小的石油醚相,根據(jù)化學(xué)成分分析結(jié)果可知,毛蚶石油醚相主要含有甾體和脂肪酸等成分,以膽甾醇為主,根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]推測(cè)毛蚶中所含的抗菌化學(xué)成分可能是極性較小的甾體類化合物。

表3 毛蚶石油醚相GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of the petroleum ether fraction from S. subcrenata

表4 甾醇組分GC-MS分析Table 4 The GC-MS analysis of the sterol component from S. subcrenata

本研究首次對(duì)毛蚶軟組織的抗菌化學(xué)成分進(jìn)行了分析,共鑒定出30個(gè)低極性化合物,從其甾體組分中鑒定出8個(gè)甾體,以膽甾醇為主,其中7個(gè)為首次分離鑒定,這些化合物的抑菌活性還有待于進(jìn)一步檢測(cè)。毛蚶石油醚相雖然有抑菌效果,但是乙醇提取物卻沒有抑菌活性,可能是因?yàn)槊捞崛∥镏械母鞣N抗菌有效成分之間存在著活性相互制約或抑制的作用,即只有當(dāng)除去或降低對(duì)抗菌活性成分發(fā)生作用的其它次生代謝產(chǎn)物時(shí),才能表現(xiàn)出明顯的抑菌活性,由于動(dòng)物天然的多糖、寡糖、糖肽、蛋白質(zhì)等對(duì)免疫系統(tǒng)有促進(jìn)作用[19],因而極大地影響了粗提物中抗菌有效成分作用的發(fā)揮,因此,要使中藥走向現(xiàn)代化,走向國際化,就必須加快中藥的有效活性成分的提取和分離研究[20]。

[1]姜鳳吾,張玉順.中國海洋藥物辭典[M].北京:海洋出版社,1994:50-53.

[2]海軍后勤部衛(wèi)生部,上海醫(yī)藥工業(yè)研究院.中國藥用海洋藥物[M].上海:上海人民出版社.1977:67-69.

[3]李謙,李泰明,王香琴,等.毛蚶提取物生化性質(zhì)初步分析[J].藥物生物技術(shù),1999,5(4):245-246.

[4]何赟綿,陳宇星,劉純慧,等.毛蚶多糖的分離純化和免疫活性測(cè)定[J].中國海洋藥物,2007,26(2):23-25.

[5]王勇,楊靜,孫峋,等.毛蚶提取物的抗氧化活性進(jìn)行了分析[J].中國海洋藥物,2008,27(3):11-14

[6]任勝芳,宋麗艷,嚴(yán)春艷,等.毛蚶中抗癌活性肽高效液相指紋圖譜分析研究[J].中藥材,2008,31(8):1134-1138.

[7]郭道森,魏玉西,李麗,等.毛蚶血漿中抗菌蛋白的純化及抗菌活性研究[J].海洋科學(xué),2005,29(3):25-29.

[8]Chen L L,Song L Y,Li T F,et al.A New Antiproliferative and Antioxidant Peptide Isolated fromArcasubcrenata[J].Mar Drugs,2013,11(6):1800-1814.

[9]Hu X J,Song L Y,Huang L J,et al.Antitumor Effect of a Polypeptide Fraction fromArcasubcrenatainVitroandinVivo[J].Mar Drugs,2012,10(12):2782-2794.

[10]He Y M,Liu C H,Chen Y X,et al.Isolation and structural characterization of a novel polysaccharide prepared formArcasubcrenataLischke[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2007,104(2):111-116.

[11]徐艷,童萬平,孫雪萍.毛蚶克生活性篩選及低極性組分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2014,25(4):811-813.

[12]孫雪萍,徐艷,宋成芝,等.毛蚶正丁醇相抗鹵蟲化學(xué)成分分析[J].廣西科學(xué),2013,20(4):272-275.

[13]黃培堂,王嘉璽,朱厚礎(chǔ).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2002,1932-1940.

[14]Espine-ingroff A,White T,Pfaller M A.Antifungal Agents and Susceptibility Tests. Manual of Clinical Microbiology[M].7th Edn. Washington DC:American Society for Microbiology,1999:1640-1652.

[15]Sydney M M,Finegold M D,Ellen Baron J O.Banley and Scotts Diagnostic Microbiology[M].7ed. 1986:176-177.

[16]范亞葦,鄧澤元,余永紅,等.不同脂肪酸甲酯化方法對(duì)共軛亞油酸分析的影響[J].中國油脂,2007,32(1):52-55.

[17]彭燕,黃日明,鄭建仙,等.中華疣海星的化學(xué)成分及其抗菌活性研究[J]. 中草藥,2012,43(10):1913-1915.

[18]胡靜,楊斌,孫見凡,等.南海軟海綿 Halichondria sp.化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(5):614-617.

[19]駱和生,羅鼎輝.免疫中藥學(xué)—中藥免疫藥理與臨床[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1999,15-25.

[20]張存莉,朱瑋,王冬梅,等.黑刺菝葜根提取物的抑菌活性研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2005,25(12):2529-2532.

Antibacterial activities and GC-MS analysis of low polar components fromScapharcasubcrenataLischke

XU Yan1,ZHANG Xiu-guo2,HUANG Guo-qiang1,ZHANG Qin1,YANG Jia-lin1,SUN Xue-ping1,*

(1.Guangxi Institute of Oceanology,Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology,Beihai 536000,China;2.Beihai College of Beihang University,Beihai 536000,China)

Objective:To screen the antibacterial fractions and constituents ofScapharcasubcrenataLischke. Methods:The soft tissues ofS.subcrenatawas extracted by ethanol. Liquid-liquid extraction with petroleum ether,ethyl acetate,n-butanol and water was used for the separation of ethanolic extract and 4 organic fractions were obtained. The antibacterial activities of the ethanolic extract and organic fractions was evaluated by diameter of inhibition zone(DIZ)and the minimum bactericidal concentration(MBC). The active petroleum ether fraction was separated and purified with silica gel column chromatography,and a sterol mixture was obtained. The compounds in the petroleum ether fraction and the sterols were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). Results:The antibacterial substances were mainly in the petroleum ether fraction,and 30 compounds were identified by GC-MS,most of which were 1ipids and sterols. Eight compounds were identified by GC-MS from the sterol component,and seven compounds were identified for the first time fromS.subcrenata. Conclusion:The antibacterial activities of petroleum ether fraction fromS.subcrenatawere obvious,and sterol was the major compound of petroleum ether fraction.

ScapharcasubcrenataLischke;antibacterial activity;gas chromatography-mass spectrometry;sterols

2014-08-06

徐艷 (1981-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：海洋活性物質(zhì)。

*通訊作者:孫雪萍(1982-)，女，博士，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(13YJ22HYS15)； 廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻 09321004)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0127-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.017