蘇建輝,馬朝陽,楊 鹿,王洪新,2,*,高傳忠,聶榮京

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫 214122;3.銅陵瑞璞牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司,安徽銅陵 244000)

槲皮素、EGCG對膽固醇酯酶活性和膽固醇膠束抑制作用研究

蘇建輝1,馬朝陽1,楊 鹿1,王洪新1,2,*,高傳忠3,聶榮京3

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫 214122;3.銅陵瑞璞牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司,安徽銅陵 244000)

為降低膽固醇酯類水解及小腸對膽固醇的吸收,本實驗體外模擬人體小腸內(nèi)環(huán)境,研究EGCG和槲皮素對膽固醇酯酶活性及膽固醇膠束溶解度的抑制效果。同時比較了9種功能因子對膽固醇酯酶活性及膽固醇膠束溶解度的抑制效果。結(jié)果表明,槲皮素和EGCG均降低了膽固醇膠束溶解度,IC50值分別是2.2、0.08mg/mL,其抑制效果呈濃度依賴性;槲皮素和EGCG對膽固醇酯酶活性的IC50值分別是0.27、1.43mg/mL。槲皮素對膽固醇膠束溶解度的抑制效果小于EGCG,但是對膽固醇酯酶活性的抑制效果大于EGCG。結(jié)果初步證明了,槲皮素和EGCG延遲了餐后高膽固醇形成,對高血脂癥有一定的預(yù)防和治療作用。

槲皮素,EGCG,膽固醇膠束,膽固醇酯酶,降脂

近年來,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)成為威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一。CVD的主要危險因素有高血壓、高血脂、糖尿病等,其中高血脂癥多發(fā)于中老年人群。高血脂對身體的損害是隱匿的、逐漸進(jìn)行性和全身性的。研究認(rèn)為降血脂機(jī)制通過抑制胰脂肪酶的活性降低了對外源性甘油三酯的吸收,降低脂肪酸合成酶的活性而減少了脂肪的合成,加速膽固醇代謝促進(jìn)膽固醇排泄來調(diào)節(jié)膽固醇代謝[1-2]。膽固醇酯酶是催化膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸的一種酶。來自膽固醇酯的膽固醇的生物利用度是由膽固醇酯酶控制的,這與基因敲除研究的結(jié)果相符[3]。膳食中的膽固醇在人體腸道中,溶于膽固醇膠束才能被人體吸收。抑制飲食中的膽固醇吸收是降低血液中膽固醇的有效方法[4]。近幾年,國內(nèi)外大量報道證實茶多酚具有降血脂作用[5-7],兒茶素占茶葉中茶多酚總量的60%～80%,表沒食子兒茶素沒食子酸(EGCG)含量最高。槲皮素是一種天然黃酮類化合物,多以苷的形式存在于植物的花、葉、果實中,研究證實槲皮素具有擴(kuò)張血管、降血壓、降血脂、降低毛細(xì)血管通透性和脆性、防治冠心病等藥理活性[8-10]。本實驗比較分析了EGCG和槲皮素對膽固醇酯酶活性和膽固醇膠束溶解度的影響,為EGCG和槲皮素降血脂研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表沒食子兒茶素沒食子酸(EGCG)、槲皮素,絞股藍(lán)皂甙、苦瓜素、丹皮酚、魔芋多糖、葛根素純度為98%,枸杞多糖、玉竹多糖,純度為80%以上 以上均購于南京景竹生物科技公司;?；悄懰徕c(STC),膽固醇,豬胰腺膽固醇酯酶(pCE)和底物對硝基苯基丁酸酯(PNPB) Sigma公司;膽固醇檢測試劑盒 南京建成;其他試劑 國產(chǎn)分析純。

UV-2100 UNIC紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;BS-1E恒溫振蕩培養(yǎng)箱 金壇市瑞華儀器有限公司;TGL-16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 膽固醇酯酶的抑制活性測試 參照文獻(xiàn)[11],略修改,測試溫度保持在(25.0±0.2)℃。所有的反應(yīng)在含有NaCl(0.1mol/L)、對硝基苯基丁酸酯PNPB(0.2mmol/L)、?；悄懰徕cSTC(5.16mmol/L)的磷酸鈉緩沖液(0.1mol/L,pH7.04)中進(jìn)行。pCE預(yù)先溶解在高純水中;底物PNPB和抑制劑預(yù)先溶解在乙腈中,在-20℃保存。加入豬胰腺膽固醇酯酶啟動反應(yīng),25.0℃反應(yīng)5min,在405nm紫外可見分光光度計檢測。

表1 膽固醇酯酶活性測定反應(yīng)體系Table 1 Reaction system of cholesterol esterase activity

注:-加入等體積蒸餾水。

酶抑制活性的計算公式如下

抑制率(%)=100×[A-B-(C-D)]/(A-B)

式(1)

式中:A:空白管在405nm的吸光度值;B:空白對照管在405nm的吸光度值;C:抑制劑管在405nm的吸光度值;D:背景對照管在405nm的吸光度值。

1.2.2 膽固醇膠束溶解度的測定 其中1mL膠束溶液中含有10mmol/L?；悄懰徕c,2mmol/L膽固醇,5mmol/L油酸,132mmol/L NaCl,15mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)。100W,40min超聲波均質(zhì)進(jìn)行制備。37℃隔夜靜置。將空白對照,一定量的EGCG、槲皮素和殼聚糖樣品分別加入到膠束溶液中,然后將混合溶液在37℃振蕩培2h,并在16000r/min離心20min,收集上清液用試劑盒測定膠束中膽固醇含量[12]。

抑制率(%)=(空白溶液的膽固醇溶解度-樣品溶液的膽固醇溶解度)/空白溶液的膽固醇溶解度

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定指標(biāo)的數(shù)據(jù)平行測定3次后取平均值,應(yīng)用Excel和SPSSl7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用Origin8.6軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 九種功能因子對膽固醇酯酶活性的抑制效果

圖1比較了濃度為0.5mg/mL的九種功能因子對膽固醇酯酶活性的抑制效果。由圖可以看出,槲皮素對膽固醇酯酶活性抑制作用最強(qiáng)為92%,EGCG對酯酶的活性較弱為27%,已有動物實驗研究表明絞股藍(lán)皂甙有較好的降血脂效果[13],Yang Yuehui研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂甙可以降低高脂大鼠血清內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶及超氧化物歧化酶活性,同時還發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)甘油三酯及膽固醇含量降低[14],本研究發(fā)現(xiàn)其對膽固醇酯酶活性有較強(qiáng)的抑制作用,也許對膽固醇酯酶活性的作用效果也是其降脂機(jī)制的一方面。由圖1還可以看出牡丹籽油對膽固醇酯酶也有較好的抑制活性,牡丹籽油富含亞麻酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸[15]?？茖W(xué)家對于富含多不飽和脂肪酸的魚油降脂效果研究較多[16],Takuya Mori研究發(fā)現(xiàn)魚油影響了脂類代謝相關(guān)酶的活性,小鼠體內(nèi)的脂肪酸氧化及蘋果酸脫氫酶的活性也發(fā)生了變化。然而對于牡丹籽油的降血脂效果目前還沒人研究,實驗發(fā)現(xiàn)富含多不飽和脂肪酸的牡丹籽油降低了膽固醇酯酶活性,也許這也是多不飽和脂肪酸的降脂途徑。

圖1 九種功能因子對膽固醇酯酶活性抑制率Fig.1 Effect of nine functional factors on the inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities

2.2 九種功能因子對膽固醇膠束溶解度的抑制效果

體外模擬人體小腸內(nèi)的環(huán)境,圖2比較了濃度為1mg/mL的九種功能因子對膽固醇膠束溶解度的抑制效果。由圖中可以看出EGCG降低了膽固醇在膠束溶液中的溶解度,其作用效果在九種功能因子中最好。國內(nèi)外已有文獻(xiàn)資料表明苦瓜素和槲皮素對高血脂動物的降脂效果[17-18]。本研究從另一方面闡述了苦瓜素和槲皮素的降脂機(jī)制,其膽固醇的結(jié)合力稍弱于EGCG,但是也可以降低小腸內(nèi)膽固醇膠束溶解度,抑制小腸對膽固醇的吸收,實現(xiàn)降脂目的。由圖2可以看出牡丹籽油降低了膽固醇膠束的溶解度,植物油含有豐富的甾醇類物質(zhì)[19],FRED H研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇可以降低膽固醇膠束的溶解度,從而減少小腸對膽固醇的吸收。由此可以推測也許是牡丹籽油中的甾醇類物質(zhì)降低了膽固醇膠束的溶解度[20]。

圖2 九種功能因子對膽固醇膠束溶解度抑制率Fig.2 Effect of nine functional factors on the inhibition of cholesterol micelle

2.3 EGCG和槲皮素對膽固醇酯酶活性抑制效果研究

由圖3可以看出,槲皮素和EGCG對膽固醇酯酶的抑制效果表現(xiàn)出劑量依賴性,隨著濃度的增加,其抑制效果越來越強(qiáng)。槲皮素濃度在小于0.4mg/mL時,其對膽固醇酯酶的抑制效果隨濃度增加,增長很快,0.4mg/mL以后抑制效果對濃度的依賴性減弱,在0.5mg/mL時,抑制率達(dá)到92.3%,其IC50為0.27mg/mL。Piotr研究槲皮素對高膽固醇血細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)其有很高的抗氧化性同時降低了高膽固醇血細(xì)胞細(xì)胞膜的膽固醇含量[13]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以很強(qiáng)的抑制膽固醇酯酶活性。相比于槲皮素,EGCG對膽固醇酯酶活性的抑制效果明顯較弱,其對酶活性的抑制效果也是呈現(xiàn)劑量關(guān)系,在1.5mg/mL后逐漸出現(xiàn)平臺期,在2.0mg/mL時其抑制率為59.6%,IC50為1.43mg/mL?，F(xiàn)有研究較多的是EGCG和槲皮素黃酮類物質(zhì)對胰脂肪酶活性的研究,EGCG對胰脂肪酶有較強(qiáng)的抑制活性,抑制了小腸對脂肪的吸收[21]。Chan等研究發(fā)現(xiàn)茉莉花茶兒茶素可以劑量依賴性地降低倉鼠血清TC水平,且排泄物中中性固醇和酸性固醇的濃度很高,但膽固醇合成的限速酶3-羥-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶和乙酰輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的活性未改變[22]。目前對膽固醇酯酶活性的研究較少,Li研究了膦香豆素對膽固醇酯酶活性的抑制效果[11],比較了不同單體的IC50。目前還沒有EGCG和槲皮素黃酮類對膽固醇酯酶活性的研究的報道,其不同的作用效果也許是因為不同位點羥基官能團(tuán)。具體機(jī)制還有待研究。

圖3 EGCG和槲皮素對膽固醇酯酶活性的抑制效果Fig.3 Effect of EGCG and quercetin on the inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities

2.4 EGCG和槲皮素對膽固醇膠束溶解度的抑制效果分析

對于殼聚糖的降血脂機(jī)制目前研究較多的是其與膽固醇、膽酸鹽的物理性吸附[23-25],本實驗體外模擬人體小腸條件,以殼聚糖為對照,比較了EGCG、槲皮素與膽固醇結(jié)合能力。由圖4可以看出,三者與膽固醇的結(jié)合力呈現(xiàn)劑量依賴性,隨著樣品濃度增加,膽固醇在膠束中的溶解度逐漸降低。三者都可以降低膽固醇在膠束溶液中的溶解度,比較三者與膽固醇的結(jié)合力發(fā)現(xiàn),EGCG與膽固醇結(jié)合力最強(qiáng),0～0.1mg/mL時作用效果最強(qiáng),0.1mg/mL后抑制速率減慢,1mg/mL時達(dá)到100%。其IC50為0.08mg/mL。由圖中可以看出槲皮素與膽固醇的結(jié)合力弱于EGCG,2mg/mL時對膽固醇膠束的溶解度抑制率是56.9%,以后抑制速率逐漸減慢,4mg/mL時為73.5%,IC50為2.2mg/mL。本實驗研究發(fā)現(xiàn)低濃度殼聚糖與膽固醇的結(jié)合力小于EGCG和槲皮素,其IC50大于5.0mg/mL,殼聚糖與膽固醇結(jié)合力的大小,也許是和殼聚糖的脫乙酰程度或者是殼聚糖的粒徑有關(guān)[25]。Marioa研究發(fā)現(xiàn)茶黃素降低了膽固醇在膠束溶液中的溶解度,通過粒徑大小分析和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膠束溶液中加入茶黃素后,形成了大顆粒[26]。EGCG和槲皮素也許是和膽固醇結(jié)合形成了大顆粒不能溶于膠束溶液,降低了其在膠束溶液中的溶解度,具體機(jī)制還有待研究。

圖4 EGCG和槲皮素對膽固醇膠束溶解度的抑制效果Fig.4 Effect of EGCG and quercetin on the inhibition of cholesterol micelle

3 結(jié)論

比較了9種功能因子對膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的影響,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、皂甙和牡丹籽油對膽固醇酯酶活性有較好的抑制效果。EGCG和苦瓜素可以很明顯的降低膽固醇在膠束中的溶解度。然而,多糖類物質(zhì)對膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的作用效果較弱。槲皮素和EGCG一方面抑制膽固醇酯分解為游離的膽固醇,另一方面降低膽固醇在膠束溶液中的溶解度,抑制了小腸對膽固醇的吸收,起到了降脂的目的。

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Inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities and cholesterol micelle of EGCG and quercetin

SU Jian-hui1,MA Chao-yang1,YANG Lu1,WANG Hong-xin1,2,*,GAO Chuan-zhong3,NIE Rong-jing3

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122，China;2.National Engineering Research Center for Functional Food,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Anhui Tongling Ruipu Peony Industry Development Co.,Ltd.,Tongling 244000,China)

The aim of the present study is to investigate the effect of EGCG and quercetin on the inhibition of pancreatic cholesterol esterase activities and cholesterol micelle formation which may result in a reduced cholesterol absorption and hydrolysis of dietary cholesterol esters. The inhibition of nine functional factors on pancreatic cholesterol esterase activities and cholesterol micelle formation were compared. The results showed that both of EGCG and quercetin had obvious effect on inhibiting cholesterol micelle formation and the 50% inhibiting concentration(IC50,mg/mL)of each was 0.08,2.2mg/mL,which was lower than chitosan. The IC50of EGCG and quercetin on pancreatic cholesterol esterase was 1.2,0.28mg/mL. The inhibition of cholesterol micellization by quercetin was weaker than EGCG,but quercetin showed stronger pancreatic cholesterol esterase inhibitory activity. It was suggested that EGCG and quercetin may delay postprandial hypercholesterolaemia,and therefore may be applied for the prevention and treatment of hyperlipidaemia.

quercetin;EGCG;cholesterol micelle;pancreatic cholesterol esterase;hypolipidemic

2014-07-24

蘇建輝(1981-),女,博士研究生,研究方向:食品營養(yǎng)與功能因子。

*通訊作者:王洪新(1981-),男,博士,教授,研究方向:食品營養(yǎng)與功能因子。

國家125項目(2012BAD33B05)；功能食品設(shè)計及制造關(guān)鍵技術(shù)與產(chǎn)品;安徽銅陵瑞璞牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司合作項目。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0346-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.062