白云金，唐 寅，韓 平，李 響，李 虹，魏 強(qiáng)

(四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610041)

·臨床研究·

循環(huán)腫瘤細(xì)胞與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

白云金，唐 寅，韓 平，李 響，李 虹，魏 強(qiáng)

(四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610041)

目的 探討循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)與膀胱癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。方法 采集78例膀胱癌患者(膀胱癌組)和10例同期非腫瘤患者(對照組)外周靜脈血，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45表達(dá)陰性且CK8/18/19表達(dá)陽性的CTC，分析CTC與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果 78例膀胱癌CTC陽性率為34.6%(27/78)，對照組均未檢出CTC，兩組CTC檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；膀胱癌CTC陽性率與腫瘤大小、數(shù)目、T分期以及病理分級有關(guān)(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析顯示，CTC陽性率與腫瘤大小、T分期和病理分級有關(guān)(P<0.05)。 CTC陽性率腫瘤直徑≥3 cm者為51.52%(17/33)，<3 cm者為22.22%(10/45)；肌層浸潤者為59.09%(13/22)，非肌層浸潤者為25%(14/56)；病理高分級者為52%(13/25)，低分級陽性率為26.42%(14/53)。結(jié)論 CTC 與膀胱癌患者腫瘤大小、浸潤深度和病理分級具有相關(guān)性。

膀胱腫瘤；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；臨床病理特征；流式細(xì)胞術(shù)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率和死亡率均居泌尿系腫瘤的首位[1-2]。對于肌層浸潤性膀胱癌，根治術(shù)后5年生存率為26%～64%，多數(shù)患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移[2-4]。因此，對行根治手術(shù)者需進(jìn)一步分層和動(dòng)態(tài)監(jiān)測，并適當(dāng)選擇多模式治療措施，以提高膀胱癌生存率。血行播散是膀胱癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，而外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)的存在是血行播散的表現(xiàn)。研究證實(shí)CTC與多種腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，包括乳腺癌、直腸癌和前列腺癌等[5]。本研究旨在運(yùn)用多標(biāo)志物聯(lián)合的流式細(xì)胞術(shù)檢測膀胱癌患者的CTC，分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集華西醫(yī)院2014年10月至2015年1月病理證實(shí)為膀胱癌患者78例(皆無其他惡性腫瘤病史且未接受任何抗腫瘤治療)，其中男58例，女20例；年齡42～80歲，平均(66.14±9.94)歲；單純尿路上皮癌67例，尿路上皮癌合并腺樣或鱗狀分化9例，尿路上皮癌合并小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，鱗狀細(xì)胞癌1例；腫瘤直徑<3 cm 45例，直徑≥3 cm 33例；單發(fā)54例，多發(fā)24例；非肌層浸潤56例，肌層浸潤22例；根據(jù)WHO 2004年膀胱腫瘤組織學(xué)分級，低級別癌53例，高級別癌25例。另收集10例非腫瘤患者作為對照組，其中結(jié)石患者6例、腎盂輸尿管連接處狹窄3例、精索靜脈曲張1例。

1.2 CTC檢測方法 應(yīng)用EDTA抗凝真空采血管采集患者術(shù)前肘正中靜脈血4 mL(棄穿刺后的前2 mL，4 h內(nèi)處理)。在離心管中加入4 mL人淋巴細(xì)胞分離液，將等量PBS液稀釋后的靜脈血貼壁緩慢加入人淋巴結(jié)細(xì)胞分離液上層。水平離心機(jī)4℃下2 000 r/min離心15 min?？梢婋x心管自下而上出現(xiàn)5 層，分別為紅細(xì)胞層、粒細(xì)胞層、透明分離液層、白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層和血漿層，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，PBS液洗滌離心2次(若有紅細(xì)胞則加紅細(xì)胞裂解液)。加入500 μL預(yù)冷(4 ℃)固定液，避光孵育10 min；PBS液洗滌離心，重懸細(xì)胞后加入Anti-CD45-PE-Cy7 10 μL(購自美國BD公司)，4 ℃下避光孵育20 min； PBS液洗滌離心，再加入1 mL破膜劑混勻，4 ℃下避光孵育2 min；PBS液洗滌離心，加入10 μL Anti-CK8/18/19-FITC(購自德國美天旎公司)混勻，4 ℃下避光孵育20 min；PBS液洗滌離心棄上清，加1%多聚甲醛500 μL，固定3 min，洗滌離心2次，重懸細(xì)胞至300 μL后放置4 ℃冰箱避光保存，以備流式細(xì)胞術(shù)檢測(FC500MCL/MPL流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司)。每例樣本在流式細(xì)胞儀上檢測(1～2)×106個(gè)細(xì)胞，結(jié)果以外周血每106單個(gè)核細(xì)胞中 CD45(-)CK8/18/19(+) 細(xì)胞數(shù)來表示外周血中CTC數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析。均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對照組中均未檢出CTC，膀胱癌組中27例檢出CTC，陽性率為34.6%(27/78)，CTC數(shù)值為1～104個(gè)，其中7例患者 CTC為1個(gè)，54例患者CTC數(shù)為2～10個(gè)，中位數(shù)6個(gè)，兩組CTC陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

單因素分析(表 1)，腫瘤直徑≥3 cm患者CTC陽性率較腫瘤直徑<3 cm患者高(51.52%vs. 22.22%，P<0.05)；腫瘤多發(fā)者CTC陽性率較單發(fā)者高(50.00%vs. 27.78%，P<0.05)；腫瘤病理高分級患者CTC陽性率較低分級患者高(52.00%vs. 26.42%，P<0.05)；肌層浸潤性膀胱癌CTC陽性率明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌(59.09%vs. 25.00%，P<0.05)。而年齡、性別、吸煙史、有無腎積水以及腫瘤組織學(xué)類型之間，CTC陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Logistic多因素回歸分析表明，膀胱癌患者CTC陽性率與患者年齡、性別、吸煙史以及腫瘤病理類型臨床分期均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤大小、T分期和病理分級有密切關(guān)系(P<0.05)。

表1 CTC陽性與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 [例(%)]

續(xù)表1 CTC陽性與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 [例(%)]

*連續(xù)校正；#：尿路上皮癌伴鱗狀或腺樣分化或合并小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和鱗狀細(xì)胞癌。

3 討 論

膀胱腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。文獻(xiàn)報(bào)道，非肌層浸潤性膀胱癌電切術(shù)后1年復(fù)發(fā)率約10%～28%[6-8]，所有患者中將有10%～20%進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌[9]；根治性膀胱切除術(shù)仍是高危非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式，但根治術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為20%，其中有高達(dá)50%患者將形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶或死于膀胱癌，其主要原因在于手術(shù)前已存在微轉(zhuǎn)移灶[10]。研究證實(shí)約50%初治肌層浸潤性膀胱癌患者可能已存在微轉(zhuǎn)移[11]。然而，傳統(tǒng)影像學(xué)并不能早期發(fā)現(xiàn)小體積轉(zhuǎn)移灶。因此，臨床急需尋找能準(zhǔn)確檢測微轉(zhuǎn)移灶和預(yù)測復(fù)發(fā)的新手段，這將有助于指導(dǎo)治療策略的選擇，對于高?；颊呖蛇x擇多模式聯(lián)合治療，對于局部治療可治愈的患者可避免全身系統(tǒng)治療的毒副作用。

CTC是自發(fā)或因診療操作由腫瘤原發(fā)部位進(jìn)入外周循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，其在腫瘤確診、治療決策、監(jiān)控輔助治療療效和識別被掩蔽的微轉(zhuǎn)移灶有很重要的作用。薈萃分析證實(shí)CTC的檢測不僅可作為膀胱癌的診斷依據(jù)，還可作為浸潤性膀胱癌鑒定指標(biāo)，能提示術(shù)前臨床分期過低(≤Ⅱ期的患者可能為Ⅲ-Ⅳ期)[12]。與傳統(tǒng)診斷手段相比，CTC數(shù)量的改變先于影像學(xué)檢查的改變[13]，因此可作為微轉(zhuǎn)移灶形成早期的監(jiān)控和檢測手段。RINK等[10]運(yùn)用CellSearch系統(tǒng)檢測100例局限性膀胱癌患者的外周血CTC，結(jié)果顯示手術(shù)前外周血CTC陽性率為23%(23/100)，平均隨訪16月，CTC陽性患者較陰性患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(52%vs.13%，P<0.05)，多因素分析顯示，CTC的狀態(tài)是膀胱癌患者腫瘤復(fù)發(fā)(HR=4.60，P<0.001)和腫瘤特異生存(HR=5.22，P=0.002)的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。FLAIG等[14]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移膀胱癌患者中CTC陽性率為50%(7/14)，中位隨訪337 d， 7例CTC陽性者全部死亡，而7例CTC陰性患者3例(43%)死亡，研究提示CTC陽性轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者具有更短的生存期。

目前檢測CTC常用的方法是CellSearch系統(tǒng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR等，CellSearch系統(tǒng)是目前唯一通過美國食品藥品管理局認(rèn)證可用于乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌CTC 檢測的方法，但其價(jià)格昂貴，臨床較難普及；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞數(shù)少，檢出率低；RT-PCR具有較高的假陽性率。而流式細(xì)胞術(shù)是利用熒光標(biāo)記相應(yīng)抗體檢測CTC，該法敏感度較低(10-6，即外周血每106個(gè)細(xì)胞含1個(gè) CTC即可檢出)，只能間接反映腫瘤患者外周血液CTC的數(shù)量，且該法需固定細(xì)胞將影響后期研究(如細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞生物學(xué)行為等)；其優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，費(fèi)用較低、操作簡便、快速、數(shù)據(jù)精確，適用臨床普查。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測78例膀胱癌患者外周血CTC，結(jié)果顯示CTC檢出率為34.6%。我們還分析了外周血CTC與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示膀胱癌CTC陽性率與腫瘤大小、數(shù)目、T分期以及病理分級相關(guān)(P<0.05)，多因素分析顯示，CTC陽性與腫瘤大小、T分期和病理分級相關(guān)(P<0.05)。雖然在外周血液中檢測到CTC并不意味著必定形成轉(zhuǎn)移灶，但可提示腫瘤浸潤性強(qiáng)，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移幾率大[15]。因此，CTC的檢測有助于及早確定轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)高危人群，對臨床醫(yī)師準(zhǔn)確判斷預(yù)后和病情具有重要指導(dǎo)作用。動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者CTC變化，有利于及早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、及時(shí)評估療效及預(yù)后，為患者選擇合理化及個(gè)體化治療方案提供依據(jù)。本研究僅初步探討了CTC與膀胱癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，未來的研究將通過長期隨訪，進(jìn)一步闡述CTC與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系，并對CTC在膀胱癌綜合治療中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行深入探討。

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(編輯 何宏靈)

Association between circulating tumor cells and clinicopathologic characteristics of bladder cancer

BAI Yun-jin, TANG Yin, HAN Ping, LI Xiang, LI Hong, WEI Qiang

(Department of Urology,West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Objective To investigate the association between circulating tumor cells (CTCs) and clinicopathologic characteristics of bladder cancer. Methods The peripheral venous blood samples were collected from 78 patients with bladder cancer and 10 patients with non-tumor diseases. CTCs in the samples were detected with flow cytometry with anti-CD45 antibody and anti-CK8/18/19 antibody. The association between CTC and clinicopathologic characteristics of tumors was analyzed. Results The positive rate of CTCs in bladder cancer was 34.6% (27/78), while CTCs were not detected in any non-tumor patients. The positive rate of CTCs in peripheral blood was correlated with tumor size, number of tumor, T stage, and pathological grade. In multivariate analysis, positive CTCs showed correlation with tumor size, T stage, and pathological grade (P<0.05). Conclusion The positive rate CTCs is significantly correlated with the diameter, T stage, and pathological grade of bladder tumor.

bladder neoplasms; circulating tumor cells; clinicopathological characteristics; flow cytometry

2015-03-10

2015-05-24

國家自然科學(xué)基金(No.81270841)；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃(No.2013SZ0034)

韓平. E-mail:hanpinghxyy@163.com

白云金(1989-)，男(漢族)，碩士.研究方向：膀胱腫瘤.E-mail：baiyunjin@163.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.09.003