梁劍光,顧秋憶,秦修東,陳中兵,余華順,姚 娟

(1.常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.浙江升華拜克生物股份有限公司，浙江湖州 223232；3.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 215500)

利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育高產(chǎn)核酸酶P1菌株

梁劍光1,2,顧秋憶1,秦修東1,陳中兵2,余華順3,姚 娟3

(1.常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.浙江升華拜克生物股份有限公司，浙江湖州 223232；3.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 215500)

為提高核酸酶P1的發(fā)酵酶活,以桔青霉菌株CK-3為出發(fā)菌株,利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變方法,獲得了3株(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)高產(chǎn)核酸酶P1菌株,其中CK-3-9突變株酶活較高,其核酸酶Pl發(fā)酵酶活達到1232 U/mL,比出發(fā)菌株CK-3(酶活866 U/mL)提高到了42.2%,遺傳實驗表明穩(wěn)定性好,有望用于工業(yè)化生產(chǎn)。

核酸酶P1,桔青霉,ARTP,誘變

核酸酶P1(Nuclease P1,EC3.30.1),又名5′-磷酸二酯酶,是一種含鋅的金屬酶,核酸酶P1能水解RNA和熱變性DNA得到5′-核苷酸,可用于食品調(diào)味劑(呈味核苷酸)和核苷酸醫(yī)藥工業(yè),具有廣泛的實用價值,在核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中起到的重要作用[1]。1960年日本科學家發(fā)現(xiàn)5′-肌苷酸具有強烈鮮味首先將核苷酸類物質(zhì)作為鮮味劑生產(chǎn),并于上世紀60年代后日本成為核苷酸增鮮劑的最大生產(chǎn)國[2]。國內(nèi)采用深層發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1的廠家?guī)缀鯖]有,導致價格被日本味之素企業(yè)壟斷,其主要原因是發(fā)酵生產(chǎn)菌種產(chǎn)酶水平低,導致生產(chǎn)成本居高不下,因此,如何獲得高產(chǎn)核酸酶P1的生產(chǎn)菌種是解決生產(chǎn)核酸酶P1的關(guān)鍵技術(shù)之一[3]。常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma ARTP)具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優(yōu)點[4-5]。ARTP放電均勻穩(wěn)定、活性粒子濃度高、操作簡便、誘變快速、環(huán)境友好、對操作者安全無輻射、操作可控性強等特點,已成為一種應用廣泛的、快速高效的新型生物誘變育種方法[6]。到目前為止,ARTP 誘變育種儀已經(jīng)成功應用于包括細菌、真菌、微藻在內(nèi)的多種微生物,并且突變率和正突變率均較高,突變株遺傳穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點[7]。本實驗以核酸酶P1的產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株,利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變篩選高產(chǎn)核酸酶P1菌株,從而獲得高產(chǎn)菌種,有望用于工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖,魚粉蛋白胨,蔗糖,吐溫-80,鉬酸銨,高氯酸,酵母核糖核酸RNA等實驗試劑 國藥集團。

桔青霉 出發(fā)菌種CK-3 常熟理工學院微生物與分離工程實驗室。

常壓室溫等離子體(ARTP)思清源生物科技有限公司;霉菌培養(yǎng)箱 MP-160B型 上海申賢設(shè)備廠;大容量恒溫培養(yǎng)搖床 SPH-211型 上海世平實驗設(shè)備有限公司;紫外可見分光光度計UNIKONXS型, 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 斜面和平板培養(yǎng) 斜面和平板培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂粉2%,pH自然。用接種環(huán)挑取一環(huán)于無菌生理鹽水中進行稀釋(10-7),涂布于斜面或平板上,放置于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)5 d。

1.2.2 種子培養(yǎng)及發(fā)酵方法 采用一級種子發(fā)酵方法,具體如下:種子培養(yǎng)基(質(zhì)量體積分數(shù)):葡萄糖3%,蛋白胨0.15%,KH2PO40.15%,K2HPO40.15%,MgSO40.24%,CaCl20.15%,pH6.5。從母瓶中挖取約1 cm2菌苔接種于250 mL三角瓶(裝液量40 mL)的液體種子培養(yǎng)基中,在28 ℃,轉(zhuǎn)速250 r/min,搖床培養(yǎng)24～26 h。

產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)):蔗糖1.5%,蛋白胨0.6%,KH2PO40.05%,K2HPO40.05%,MgSO40.04%,CaCl20.08%,ZnSO40.02%,吐溫80 0.05%,pH6.5。從液體種子培養(yǎng)基中移取3 mL種子液到250 mL三角瓶(裝液量30 mL)的產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,28 ℃,轉(zhuǎn)速250 r/min,搖床培養(yǎng)66～72 h,測定發(fā)酵液酶活。

1.2.3 ARTP 誘變方法 參考文獻[8-9]進行。用10 mL無菌生理鹽水加入1支斜面孢子,震蕩1 min后菌液顏色變深,適當用無菌水稀釋成不同濃度(10-4,10-5,10-6,10-7,10-8)。用移液槍取出適量在ARTP誘變金屬片上,依照說明書操作,其主要流程如圖1[10]。在誘變過程中,大部分孢子死亡,只少部分處理后的孢子存活下來,可以用致死率來表示。因此,致死率是指經(jīng)過誘變處理后,死亡的細菌或孢子與處理之前的細菌或孢子總數(shù)的比值。本實驗在測定時候,取同一份孢子懸液,分成兩份,一份經(jīng)誘變處理后進行平板計數(shù),另一份不誘變就進行平板計數(shù),然后將兩者結(jié)果進行比較即可。具體計算公式如下:

致死率(%)=未經(jīng)處理平板菌落總數(shù)-經(jīng)過處理后的平板菌落總數(shù)/未經(jīng)處理平板菌落總數(shù)×100

圖1 ARTP誘變基本流程圖Fig.1 The basic flow of the ARTP mutation

1.2.4 核酸酶P1測定 參考文獻[11],略有改動。在試管中加入1.9 mL底物溶液(3% 酵母核糖核酸RNA,煮沸20 min,調(diào)節(jié)pH到5.0,用pH為5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液定容),置于68 ℃水浴保溫10 min后,加入預處理好的發(fā)酵液0.1 mL,繼續(xù)保溫15 min后,置冰水中冷卻,迅速加入2.0 mL核酸沉淀劑(0.25%鉬酸銨-2.5%高氯酸),繼續(xù)冷卻10 min,于3500 r/min離心15 min,取0.2 mL上清液加雙蒸水稀釋定容至50 mL,于260 nm處測定吸光度。

空白對照:1.9 mL底物,在68 ℃保溫25 min,加入核酸沉淀劑2.0 mL,再加酶液0.1 mL,余下步驟同樣品測定。上述測酶活的條件下,每min所生成的核苷酸量在260 nm光密度為1.0時,定義為1個酶活單位。

相對酶活(U/mL)=篩選后的菌株酶活-對照菌株酶活/對照菌株酶活×100%

本文所有的酶活測定均為三個平行樣的平均值。

1.2.5 高產(chǎn)菌株篩選方法 初篩:菌懸液經(jīng)過ARTP誘變處理后,適當稀釋涂平板,在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,觀察菌落孢子量和顏色并測定菌落直徑大小,選取孢子量多,菌落直徑相對較大的菌落進行搖瓶發(fā)酵驗證。復篩:在初篩菌株基礎(chǔ)上,對酶活較高的菌株進行在進行一輪ARPT誘變,通過搖瓶發(fā)酵,選取酶活更高的菌株。

1.2.6 突變株菌落形態(tài)變化 以CK-3菌株為出發(fā)菌株,其孢子經(jīng)過ARTP處理后,稀釋涂布于PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)4 d,觀察菌落形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變處理時間的選擇

桔青霉菌株孢子外壁較厚,物理處理孢子誘變時間一般在1 min以上。因此,本實驗ARTP 誘變處理時間單位為分鐘(min)。實驗結(jié)果見圖2,橫坐標表示處理時間(min),縱坐標為孢子致死率(%)。從圖2中可知,桔青霉菌株孢子在ARTP處理過程中,隨著處理時間的增加,致死率在不斷增加,當處理時間為3 min后,孢子致死率達到93.3%,超過4 min時,孢子致死率接近100%,桔青霉菌株孢子幾乎都被殺死。因此,本實驗ARPT處理桔青霉孢子時間為3～4 min即可。

表1 等離子誘變初篩突變菌株的酶活

圖2 ARPT誘變致死率曲線Fig.2 Variation of the lethality rate by ARTP with different exposure time

注:酶活為三個平行樣的平均值。

2.2 ARPT誘變高產(chǎn)突變株選育

2.2.1 突變株菌落形態(tài)變化 通過第一輪ARTP誘變,獲得11株相對高產(chǎn)的突變菌株(編號依次為CK-3-1,CK-3-2,CK-3-3,CK-3-4,CK-3-5,CK-3-6,CK-3-7,CK-3-8,CK-3-9,CK-3-10,CK-3-11)。各突變株的菌落形態(tài)圖。

根據(jù)圖3菌落形態(tài)顏色可看出菌落CK-3-1、CK-3-2、CK-3-3與CK-3-9的菌落顏色都發(fā)生了較為明顯的變化:CK-3-1與CK-3-9的菌落顏色偏深灰色且菌落直徑較大,菌落生長較為旺盛;CK-3-2與CK-3-3菌落顏色偏深灰綠色。從菌落大小上來看,大多數(shù)突變菌株的生長較出發(fā)菌株偏大,突變株培養(yǎng)4 d菌落直徑就達到1.5 cm,而出發(fā)菌株培養(yǎng)5 d左右菌落直徑才能達到1.5 cm(見表1)。從菌落顏色的變化間接證明了菌株的代謝產(chǎn)物發(fā)生了一定的變化,而菌落大小說明了突變株的生長速度較快。

圖3 ARPT誘變后菌落與出發(fā)菌落對比Fig.3 The comparison between CK-3 strian and the ARPT mutation strains

2.2.2 突變株發(fā)酵性能初步篩選 參照1.2.5實驗方法,在平板上挑取各突變株菌落進行菌株篩選發(fā)酵性能驗證,結(jié)果見表1。從相對酶活結(jié)果來看,共有3株突變菌株(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)獲得相對酶活7%以上的提高,分別為107.4%,114.3%和116.4%。11株突變株的菌落形態(tài)顏色變化較大,CK-3-1和CK-3-9均為深灰色,說明深灰色菌落可能孢子量較多,酶活相對較高,將3株突變株保存,進行下一步實驗。

2.2.3 高產(chǎn)突變株發(fā)酵復篩 在初篩突變菌株CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9基礎(chǔ)上,對3株突變菌進一步發(fā)酵復篩,實驗條件和培養(yǎng)基與 出發(fā)菌株相同,進行搖瓶發(fā)酵復篩。在實驗過程中,因CK-3-9最為明顯,以CK-3-9 與出發(fā)菌株對照比較為例,發(fā)現(xiàn)桔青霉突變株種子液菌球形態(tài)和發(fā)酵菌球形態(tài)和顏色存在較大差異,結(jié)果見圖4。

圖4 出發(fā)菌株CK-3與突變株CK-3-9發(fā)酵過程菌形比較Fig.4 The mycelial morphology comparison between the original CK-3 strian and the ARPT mutation strain CK-3-9

經(jīng)過圖4可以看出突變株CK-3-9種子瓶中的菌球細膩,菌球小、菌球量多,種子液清澈,顏色淺;而出發(fā)菌株CK-3種子瓶的菌絲球大、菌球量少,顏色淡黃、菌液清澈。通過發(fā)酵液酶活測定,3株突變菌的發(fā)酵酶活結(jié)果見表2。

表2 等離子誘變后突變菌株的酶活

最終結(jié)果表明,以核酸酶Pl產(chǎn)生菌桔青霉CK-3作為出發(fā)菌株,經(jīng)過常壓室溫等離子體誘變處理,得到了3株高產(chǎn)核酸酶P1突變株,經(jīng)發(fā)酵復篩驗證,其中CK-3-9產(chǎn)生的核酸酶Pl酶活提高到1232 U/mL,比原始出發(fā)菌株CK-3(866 U/mL)提高了42.3%,該菌株在安琪酵母有限公司進行中試生產(chǎn),達到了工業(yè)化要求。

2.2.4 突變株遺傳穩(wěn)定性考察 對上述的3株高產(chǎn)核酸酶P1突變菌進行發(fā)酵穩(wěn)定性考察,其結(jié)果如圖5所示。

圖5 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性考察 Fig.5 Genetic stability of the high-yielding strain

從圖5中可以看出,CK-3-1、CK-3-7和CK-3-9的菌株隨著傳代次數(shù)在3代以內(nèi)酶活程增加趨勢,隨著傳代次數(shù)增加到第4和第5代,其產(chǎn)核酸酶P1的酶活均有不同程度的降低,但總的來看,3株高產(chǎn)菌株的酶活沒有大起大落,均較穩(wěn)定。核酸酶P1酶活在第2和3代有所升高可能是因為隨著傳代次數(shù)的增加,突變菌逐漸適應了外界的環(huán)境,其新陳代謝逐漸調(diào)整到最佳狀態(tài)。經(jīng)過高產(chǎn)核酸酶P1遺傳穩(wěn)定性考察,CK-3-9的酶活穩(wěn)定在1200 U/mL左右,這樣我們就得到了ARTP誘變后產(chǎn)核酸酶P1酶活高的桔青霉菌株,接近于工業(yè)化生產(chǎn)菌株。

3 結(jié)論

本文首次利用ARTP 誘變桔青霉菌株,成功獲得了3株高產(chǎn)核酸酶P1突變株,其中CK-3-9產(chǎn)生的核酸酶Pl酶活高達1232 U/mL,其遺傳穩(wěn)定性好,為工業(yè)化生產(chǎn)核酸酶P1提供了較好菌株和菌種育種科學依據(jù)。

[1]李科德,韓木蘭,柏建玲,等. 5’-磷酸二酯酶高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 微生物學雜志,200l,21(3):28-33.

[2]胡丹東,崔玉娟. 一株高產(chǎn)核酸酶P1菌株的誘變選育[J].西北師范大學學報,2008,6(44):79-93.

[3]梁劍光,黃鵬,徐正軍. 桔青霉發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1工藝條件及影響因素[J]. 中國釀造, 2007,11:27-30.

[4]金麗華,方明月,張翀. 常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性[J]. 生物工程學報,2011,27(3):461-467.

[5]夏書琴,劉龍,張東旭，等. 大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變選育谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株[J]. 微生物學通報,2010,37(11):1642-1649.

[6]Lu Yuan,Wang Liyan,Ma Kun,et al. Characteristics of hydrogen production of an Enterobacter aerogenes mutant generated by a new atmospheric and room temperature plasma(APTP)[J]. Biochemical Engineering Journal,2011,55(1):17-22.

[7]Li HP,Li G,Sun WT,et al. Radio-frequency,atmospheric pressure glow discharges:production methods,characteristics and applications in bio-medical fields[J],Complex Systems,2008,982:584-591.

[8]金麗華,方明月,張猻,等. 常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性[J]. 生物工程學報,2011,27(3):461-467.

[9]Li G,Li HP,Wang YL,et al. Genetic effects of radio-frequency,atmospheric-pressure glow discharges with helium[J]. Appl Phys Lett,2008,92:2551504.

[10]Wang L Y. Huang Z L,Li G,et al. Novel mutation breeding method forStreptomycesavermitilisusing an atmospheric pressure glow discharge plasma[J]. Applied Microbiology,2009,1365-2672.

[11]徐正軍,肖林平,呂潔等. 實驗設(shè)計法優(yōu)化核酸酶P的發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 過程工程學報,2003,3(5):433-437.

Screening of high-yield nuclease P1 strain by exposed under atmospheric and room temperature plasma

LIANG Jian-guang1,2,GU Qiu-yi1,QIN Xiu-dong1,CHEN Zhong-bing2,YU Hua-shun3,YAO Juan3

(1.School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China;2. Zhe Jiang Shenghua Biok Biology Co. Ltd,Huzhou 313220,China;3. Angel Yeast Co.Ltd.,Yichang 443003,China)

To enhance the productivity of nuclease P1 fromPenicilliumcitrinum,a novel mutation system with atmospheric and room temperature plasma(ARTP)was used. Experiment results indicated that the high-yield nuclease P1 strains(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)was obtained,and the CK-3-9 nuclease P1 enzyme activity reached 1232 U/mL,which was increased by 42.2% compared with the parent strain CK-3. The result showed that the genetic stability was good.

Nuclease P1;penicilliumcitrinum;ARTP;mutation

2015-01-26

梁劍光(1979-)，男，博士研究生，副教授，研究方向：微生物及發(fā)酵工程，E-mail:liang4523@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0183-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.029