安新煥 武會(huì)娟 梁干雄

·實(shí)驗(yàn)研究·

PCR-RLFP方法檢測(cè)eNOS G894T多態(tài)性實(shí)驗(yàn)條件研究

安新煥 武會(huì)娟 梁干雄

目的 探討聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶(eNOS) G894T多態(tài)性的最佳實(shí)驗(yàn)條件。方法 對(duì)PCR和RFLP的一些影響因素進(jìn)行研究。結(jié)果 PCR擴(kuò)增eNOS基因的最佳條件為：20 μmol/L的引物濃度； 5.0 U的Taq酶量； 112 μmol/L的dNTP濃度。20 μl體系中加4 μl產(chǎn)物, 5.0 U的酶消化4 h為最經(jīng)濟(jì)有效的酶切體系。結(jié)論 最佳的實(shí)驗(yàn)條件的探索是進(jìn)行大批量實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。

內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶；G894T；多態(tài)性； 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性；最佳實(shí)驗(yàn)條件

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 患者致命的主要原因之一 。并非所有的DM患者均發(fā)生DN, 有些患者盡管血糖控制良好, 卻發(fā)生腎損害［1］；有半數(shù)以上DM患者無(wú)論血糖控制如何終生不發(fā)生DN, 此種異質(zhì)性不能用代謝調(diào)節(jié)的差異來(lái)解釋 。因此提示遺傳因素在DN或至少在部分DN的發(fā)病中起重要作用。有研究表明, eNOS基因是DN的候選基因。在腎臟, eNOS 主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞, eNOS 是血管內(nèi)皮細(xì)胞NO 合成的主要限速因子, eNOS 的功能障礙將影響血管壁NO 基礎(chǔ)水平, 影響糖尿病微血管病變的發(fā)生。血漿NO 水平的變化30%是由于eNOS 基因多態(tài)性所致。eNOS 基因第7 外顯子G894T多態(tài)性, 可影響eNOS 蛋白功能, 使血漿NO 水平下降, 在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。另有研究表明［2］, eNOS與ACE基因多態(tài)性并存對(duì)糖尿病腎病有一定的影響。作者檢測(cè)eNOS 基因第7 外顯子G894T多態(tài)性, 并研究分析此種多態(tài)性是否與中國(guó)廣東地區(qū)漢族人DN有關(guān)系。PCR-RFLP方法借助限制性內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別堿基序列的特異性切割, 用來(lái)檢測(cè)基因片段中某一位點(diǎn)的變異情況。eNOS 基因第7 外顯子894位點(diǎn)對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶BanⅡ的酶切位點(diǎn), 酶切后有3種情況：基因型為GG的不含突變位點(diǎn), 酶切后為163 bp 和85 bp 兩個(gè)片段;TT基因型酶切后只有一個(gè)248 bp 片段, 存在G→T 點(diǎn)突變；GT基因型酶切后得到3個(gè)片段即248 bp , 163 bp 和85 bp 。

盡管PCR-RFLP是比較成熟的技術(shù), 但對(duì)于不同的模板和引物, PCR反應(yīng)所需的條件是不同的。如果實(shí)驗(yàn)條件把握不準(zhǔn)確, 可造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果, 酶切反應(yīng)對(duì)于產(chǎn)物多少、酶量及酶切時(shí)間也有講究, 對(duì)于大批量研究而言, 探索實(shí)驗(yàn)條件是必需的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器材料 基因擴(kuò)增儀BIO-RAD S1000；電泳儀Power Pac 3000型由美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)及配套的分析軟件和Power Pac1000紫外圖像分析系統(tǒng), 5417R高速冷凍離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)制造, 恒溫和可控水浴箱由上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn)制造。

1.1.2 主要試劑 由北京市理化分析測(cè)試中心合成引物：上游引物：5’-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3’, 下游引物5’-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3’ , TaqDNA聚合酶標(biāo)準(zhǔn)為5.0 U/μl、100 mmol/L的dNTP和限制性內(nèi)切酶BanⅡ均為寶生物(大連)有限公司生產(chǎn), 從天根生化科技(北京)有限公司購(gòu)得DNA分子量標(biāo)記(Marker)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模板DNA的抽提 選用QIAamp DNA Mini kit試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取模板DNA, 加入100 ml TE緩沖液, DNA沉淀物放在65℃水浴中15～20 min, 直到沉淀物質(zhì)完全溶解, 儲(chǔ)存方法:放在4℃的冰箱中。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 建立PCR擴(kuò)增目的DNA片段的實(shí)驗(yàn)條件。模板1 μl, 10×緩沖液5 μl, 加去離子水至501μl作為基本反應(yīng)體系, 對(duì)影響擴(kuò)增結(jié)果的Taq酶量、dNTP、引物的濃度等進(jìn)行變化, 按94℃預(yù)變性5 min, 后94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)：將擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl與溴酚藍(lán)加樣緩沖液2 μl混勻后和1份5μl MarKer同時(shí)加樣于2%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴乙錠), 用100 V電壓電泳30 min, 電泳后在Gel Doc1000紫外檢測(cè)系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

1.2.3 BanⅡ限制性內(nèi)切酶的酶解 GG基因型酶切后有2個(gè)片段163 bp 和85 bp；TT基因型只有1 個(gè)248 bp 的片段；GT基因型酶切后有3個(gè)片段即248 bp、163 bp和85 bp。采用過(guò)度酶量消化的辦法找到基因型為GG的野生純合子, 即5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物, 用10.0 U的內(nèi)切酶消化, 反應(yīng)體系20 μl, 然后20 μl總反應(yīng)體系不變, 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物量、內(nèi)切酶的濃度、酶切時(shí)間按梯度設(shè)定。酶切后產(chǎn)物的檢測(cè)也采用瓊脂糖凝膠電泳法,按上述同樣方法進(jìn)行加樣, 10 μl酶切產(chǎn)物在80 V電壓下電泳45 min, 然后在Gel Doc 1000紫外檢測(cè)系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1 Taq酶量設(shè)定在2.5～15.0 U之間, 其他擴(kuò)增條件不變。結(jié)果表明, 不同酶量均能擴(kuò)增出目的DNA片段, 且產(chǎn)物量無(wú)顯著性差異。所以選擇5.0 U的Taq酶量, 既有效又節(jié)省酶量。見(jiàn)圖1。

2.1.2 引物濃度設(shè)計(jì)在10～100 pmol/ul, 其他條件不變。結(jié)果是均有產(chǎn)物擴(kuò)出, 但隨著引物濃度增加, 引物二聚體也逐漸增加, 產(chǎn)物量并不增加, 所以選擇引物濃度20 pmol/ul, 此時(shí)二聚體較少, 產(chǎn)物量高。見(jiàn)圖2。

2.1.3 dNTP濃度設(shè)計(jì)在28～168 μmol/L之間, 其他擴(kuò)增條件不變。結(jié)果是隨著dNTP濃度的增加產(chǎn)物量有所增加, 但在112 μmol/L后產(chǎn)物量并無(wú)變化, 選擇其最適dNTP濃度為112 μmol/L。見(jiàn)圖3。

圖1 Taq酶量對(duì)PCR的影響注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記,依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 以及15.0 U的Taq酶量

圖2 引物濃度對(duì)PCR的影響注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記,依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分別為10、20、30、40、50以及100 pmol/ul的引物濃度

圖3 dNTP濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分別為：28、56、84、112、140和 168 μmol/L的dNTP濃度

2.2 BanⅡ內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 酶切反應(yīng)體積 50 μl的酶切體系是一般試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)體系, 而RFLP只需要酶切后電泳檢測(cè)得出酶切圖譜, 無(wú)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要, 因此設(shè)定反應(yīng)體積為20 μl即可滿足要求。

2.2.2 確定酶切所用的擴(kuò)增產(chǎn)物量 選擇GG基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)酶切, 10.0 U內(nèi)切酶, 分別消化2～8 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物,過(guò)夜酶切。結(jié)果表明：2、4、6、8 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物均可被切開(kāi),但6、8 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后雖不影響基因型判斷, 但遺留極少量未被切干凈的痕跡, 2 μl擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后電泳無(wú)法分辨基因型, 而4 μl時(shí)結(jié)果清晰可辨。所以最佳酶切產(chǎn)物量為4 μl, 既能保證酶切完全又防止擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)多對(duì)內(nèi)切酶抑制。見(jiàn)圖4。

2.2.3 酶切的酶量確定 加入4 μl擴(kuò)增產(chǎn)物量, 2.5～10.0 U將內(nèi)切酶量設(shè)計(jì)為4個(gè)梯度, 過(guò)夜酶切。結(jié)果表明：5.0、7.5、10.0 U時(shí)均呈現(xiàn)清晰的163 bp一條片段(因?yàn)?5 bp片段看不到), 而2.5 U的酶量不能完全切開(kāi), 所以選擇5.0 U內(nèi)切酶量。見(jiàn)圖5。

2.2.4 酶切時(shí)間的確定 反應(yīng)體積為20 μl, 加入4 μl擴(kuò)增產(chǎn)物, 5 U內(nèi)切酶, 酶切時(shí)間設(shè)置為1～10 h。結(jié)果表明：1 h酶切不能完全切割, 248 bp處遺留少量痕跡, 而4 h后可以完全切割, 248 bp處不留痕跡, 而且隨酶切時(shí)間延長(zhǎng)并未發(fā)現(xiàn)非特異性切割, 所以最佳酶切時(shí)間為4 h。見(jiàn)圖6。

圖4 擴(kuò)增產(chǎn)物量對(duì)酶切的影響注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1、2、3、4依次為酶切模板8、6、4、2 μl

圖5 內(nèi)切酶量對(duì)酶切的影響注：M為D2000的DNA分子量標(biāo)記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp ；1、2、3、4依次為內(nèi)切酶2.5、5.0、7.5、10.0 U的BanⅡ內(nèi)切酶量

圖6 酶切時(shí)間的確定注：D2000為DNA分子量標(biāo)記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp ；1、2、3、4 分別為酶切1、4、7、10 h

3 討論

PCR-RFLP方法是常用的檢測(cè)點(diǎn)變異的方法, 實(shí)驗(yàn)條件隨著內(nèi)切酶及切割片段長(zhǎng)度的不同而不同, 而對(duì)于大批量實(shí)驗(yàn)而言, 若要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 實(shí)驗(yàn)條件需要優(yōu)化。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物需要酶切后才能判斷基因型, 因此擴(kuò)增產(chǎn)物要求量足又要特異性高, 引物二聚體較少。對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的諸多影響因素, 作者選擇主要的影響因素如Taq酶量、引物濃度以及dNTP濃度等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。①Taq酶量：Taq酶活性對(duì)于不同來(lái)源和不同批次會(huì)有不同, 會(huì)影響擴(kuò)增效果, 所以, 同一研究中最好使用同一批次的Taq酶。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物量足夠酶切, 出于降低檢測(cè)成本考慮, 選擇低濃度的酶即可。②引物濃度：引物濃度對(duì)擴(kuò)增效率和特異性均有影響。引物濃度低擴(kuò)增效率極低, 不能滿足實(shí)驗(yàn)要求, 引物濃度過(guò)高, PCR反應(yīng)特異性下降, 錯(cuò)配增加, 引物二聚體增多［3］。③dNTP的濃度：PCR擴(kuò)增體系中有4種dNTP, 并且要求等摩爾濃度, 否則會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入, 降低新鏈合成速度［4］。dNTP濃度低時(shí)反應(yīng)產(chǎn)量也低, 而dNTP濃度高時(shí)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有抑制作用, 可能是因?yàn)閐NTP與Mg2+螯合而引起的反應(yīng)［4］。④內(nèi)切酶量以及酶切所用擴(kuò)增產(chǎn)物量：這兩種條件是密不可分的, 內(nèi)切酶量和擴(kuò)增產(chǎn)物量的多少在一個(gè)反應(yīng)體系中是相對(duì)而言的, 內(nèi)切酶量少, 產(chǎn)物切不開(kāi)或切不完全, 無(wú)法判斷結(jié)果；擴(kuò)增產(chǎn)物量多使得內(nèi)切酶量相對(duì)不足, 甚至?xí)?duì)內(nèi)切酶產(chǎn)生抑制作用［5］, 內(nèi)切酶量過(guò)多又造成浪費(fèi), 增加實(shí)驗(yàn)成本。⑤酶切時(shí)間：雖然試劑盒上都有參考的酶切時(shí)間, 但在不同的反應(yīng)體系中, 不同的實(shí)驗(yàn)條件下,需要重新確定酶切時(shí)間。酶切時(shí)間的延長(zhǎng), 并不能減少所用的內(nèi)切酶量, 反而會(huì)因?yàn)槊盖袝r(shí)間過(guò)長(zhǎng)而使內(nèi)切酶酶活性喪失, 甚至?xí)斐蓛?nèi)切酶星號(hào)活性(在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下切割與內(nèi)切酶識(shí)別順序相似的序列)的發(fā)生［5］, 時(shí)間過(guò)短又不能完全切割特異性片段, 內(nèi)切酶的作用也未發(fā)揮完全, 影響結(jié)果判斷。電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成條帶模糊不清, 甚至DNA從凝膠中泳出, 過(guò)短會(huì)造成片段分不開(kāi), 每次電泳時(shí)間不一致會(huì)造成橫向無(wú)法比較。

實(shí)驗(yàn)條件之間互相影響、互相關(guān)聯(lián), 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后確定了PCR-RFLP方法擴(kuò)增eNOS 基因第7 外顯子區(qū)進(jìn)而進(jìn)行內(nèi)切酶消化的適宜實(shí)驗(yàn)條件, 為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠奠定了基礎(chǔ)。

總之, PCR擴(kuò)增eNOS 基因第7 外顯子區(qū)的適宜條件：20 μmol /L的引物濃度；5 U的Taq酶；112 μmol/L的dNTP濃度；BanⅡ酶切的最適條件：20 μl的酶切體系中, 加入4 μl酶切產(chǎn)物, 5.0 U內(nèi)切酶, 酶切4 h。以上參數(shù)偏離最適條件將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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Experimental condition research of PCR-RLFP in detection of polymorphism of eNOS G894T

AN Xinhuan, WU Hui-juan, LIANG Gan-xiong.
Department of Endocrinology, Guangdong Zhongshan City People’s Hospital, Zhongshan 528400, China

Objective To investigate the optimum experimental condition of polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphisms (PCR-EFLP) in detection of polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) G894T.Methods Research was made on influencing factors of PCR and RFLP.Results The optimum experimental conditions for PCR in amplification of eNOS gene included primer concentration as 20 μmol/L, Taq enzyme amount as 5.0 U, and dNTP concentration as 112 μmol/L.4 μl products in 20 μl system under 4 h of 5.0 U enzymic digestion was the most financial enzymatic system.Conclusion Investigation of the optimum experimental condition is the key to implement large quantities of experiments.

Endothelial nitric oxide synthase; G894T; Polymorphism; Polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphisms; Optimum experimental condition

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.14.190

2015-04-17］

528400 廣東省中山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科(安新煥 梁干雄)；北京市理化分析測(cè)試中心(武會(huì)娟)