白鵬華等

摘要： 對天津武清區(qū)楊樹銹病病原菌進行形態(tài)學(xué)和分子技術(shù)鑒定。結(jié)果表明，該菌為落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina），其夏孢子黃色，長橢圓形或矩圓形，大?。?9.0～44.0） μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50）；基部刺細密較大，頂部刺稀疏較小；夏孢子萌發(fā)可生成多個芽管；rDNA-ITS序列長度為663 bp。

關(guān)鍵詞：落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）；夏孢子；形態(tài)學(xué)觀察；分子鑒定

中圖分類號：S432.4+4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）03-0049-03

Morphological and Molecular Identification of A Poplar Rusts Pathogen

Bai Penghua1，F(xiàn)eng Youren1，Liu Baosheng1*，Zhang Huichao2

（1.Tianjin Institute of Plant Protection，Tianjin 300381，China；

2.Jixian Station of Plant Diseases and Pests Prevention，Tianjin 301900，China）

AbstractBy the methods of morphology and molecule，the poplar rust pathogen in Wuqing district of Tianjin was classified as Melampsora larici-populina. The uredospores were yellow and oblong or rounded rectangle，the size was （29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，mean size was 35.2 um×18.4 μm（n=50）. The thorn on the bottom of the uredospore was bigger and dense，while on the top was smaller and sparse. The uredospore could germinate several tubes；the rDNA-ITS sequence of Melampsora larici-populina was 663bp.

Key wordsMelampsora larici-populina；Uredospore；Morphological observation；Molecule identification

楊樹因其生長迅速、適應(yīng)性強、品種多樣、分布廣泛且易于繁育等特性，現(xiàn)已成為主要的工業(yè)用材樹種之一[1，2]。但大規(guī)模集約經(jīng)營的楊樹人工林易受病害爆發(fā)的威脅，其中由柵銹菌屬（Melampsora spp.）引起的葉銹病是楊樹生產(chǎn)中的主要病害，阻礙楊樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

銹菌是一種專性寄生性真菌，病菌夏孢子階段，可隨氣流遠距離傳播，侵染時間長，可重復(fù)侵染楊樹葉片[3，4]。銹病一般在夏初發(fā)生，到8月末9月初就能造成落葉，嚴重時能導(dǎo)致未成熟芽早落，或使樹木易受其它病原物侵染，或易受寒害影響。柵銹菌主要為害葉片，前期夏孢子堆多生葉背面，后期密布葉片，呈黃色粉層，晚秋葉片上出現(xiàn)圓形的棕色至褐色的冬孢子堆[2，5]。本研究旨在通過形態(tài)學(xué)和分子技術(shù)鑒定來自天津武清區(qū)的楊樹葉片銹病病菌種類，為楊樹銹病病菌分子鑒定提供技術(shù)支持，并為該病害的防治提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌

2014年9月，在天津市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新（武清區(qū)）基地，采集帶有銹菌夏孢子的新鮮楊樹病葉帶回實驗室，觀察銹病癥狀，備用。

1.2形態(tài)學(xué)觀察

用滅菌潔凈小毛筆將夏孢子均勻抖落于滴有滅菌蒸餾水的載玻片上，在普通光學(xué)顯微鏡下，觀察夏孢子的形態(tài)、顏色，測量夏孢子大小。將新鮮的孢子抖落在含有0.1%葡萄糖液滴的載玻片上，放置于20℃溫箱中光照培養(yǎng)，15 h后觀察孢子萌發(fā)情況。

1.3分子鑒定

1.3.1夏孢子DNA提取采用Lysis緩沖液提取夏孢子DNA，用滅菌載玻片刮取新鮮夏孢子堆于滅菌研缽中，稱取20 mg孢子堆，置于1.5 mL離心管內(nèi)（已加入0.65 mL的 Lysis buffer），震蕩30 s再離心2 min（16 875 rcf），將0.5 mL上清液移入新離心管中（內(nèi)含100 μL乙酸甲緩沖液），將該離心管反復(fù)倒置混勻，再離心2 min（16 875 rcf），將0.5 mL上清液移入新離心管中（內(nèi)含0.5 mL異丙醇），去除上清液加0.75 mL的70%乙醇清洗DNA，離心30 s，去除乙醇，干燥DNA，后將DNA溶解于50 μL水中。

1.3.2rDNA-ITS 序列PCR擴增及擴增產(chǎn)物電泳檢測以夏孢子DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′）對病原菌的rDNA-ITS序列進行PCR擴增。取PCR產(chǎn)物2 μL，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)條帶亮度粗略估計DNA濃度，同時判別RNA和蛋白質(zhì)是否除盡。

1.3.3rDNA—ITS序列測序及同源性比對以夏孢子的ITS1和ITS4區(qū)擴增產(chǎn)物進行全序列測定[金唯智生物科技（北京）有限公司]，并將獲得的DNA序列在NCBI上進行比對。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)鑒定endprint

夏孢子堆主要生在葉背面，布滿整個葉面，散生或聚生，粉狀，鮮黃色，近圓形；夏孢子黃色，長橢圓形或矩圓形，（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小為35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺細密較大，頂部刺稀疏較?。ㄈ鐖D1-a）。夏孢子萌發(fā)可生成多個芽管（圖1-b）。產(chǎn)生有隔菌絲（圖1-c），菌絲分枝（圖1-d），并且在葉面形成白色菌絲層。

2.2夏孢子總DNA提取與rDNA-ITS序列PCR擴增

以所提DNA為模板，ITS1和ITS4為引物進行擴增，可擴增出目標條帶，目標條帶大小為663 bp，見圖2。將rDNA-ITS序列PCR產(chǎn)物進行測序，所得結(jié)果在NCBI上進行Blast，結(jié)果顯示與Melampsora larici-populina序列同源性為99%。

3結(jié)論與討論

柵銹菌屬是楊樹的重要病原菌之一，種類多，種間差異不明顯。傳統(tǒng)的分類方法是根據(jù)夏孢子、冬孢子形態(tài)及轉(zhuǎn)主寄主來區(qū)分，由于有的菌種沒有或很難發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)主寄主，有些菌種生活史沒有冬孢子階段，因此，傳統(tǒng)的分類方法有很多不確定因素[7]。本試驗結(jié)合銹菌夏孢子形態(tài)特征及分子生物學(xué)技術(shù)，準確鑒定了天津武清區(qū)楊樹銹病病原菌種類為落葉松楊柵銹菌（Melamp-sora larici-populina）。其夏孢子黃色，長橢圓形或矩圓形，大小（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺細密較大，頂部刺稀疏較?。幌逆咦用劝l(fā)可生成多個芽管；rDNA-ITS序列長度為663 bp。

由于植物病原銹菌很難在培養(yǎng)基上進行人工培養(yǎng)，在實驗室靠寄主擴繁銹菌夏孢子不僅復(fù)雜費時，而且收集的夏孢子數(shù)量有限，直接影響銹菌分子鑒定能否順利完成。因而，尋找快速簡易提取銹菌總DNA的技術(shù)非常重要。本研究采用Lysis緩沖液提取夏孢子DNA，既簡便，又減少了對夏孢子數(shù)量的過多依賴，并且成功率高，可直接用于rDNA-ITS序列PCR擴增，可為楊樹銹病的病菌分子鑒定提供了一種快速、高效提取銹菌DNA的方法。

參考文獻：

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[2]Heilman P E， Ekuan G， Fogle D. Above-and below-ground biomass and fine roots of 4-year-old hybrids of Populus trichocarpa × Populus deltoids and parental species in short-rotation culture[J].Canadian Journal of Forest Research， 1994， 24（ 6） ： 1186-1192.

[3]郝俊貞. 呼和浩特市青楊葉銹病侵染循環(huán)和發(fā)病規(guī)律的研究[J]. 內(nèi)蒙古林學(xué)院學(xué)報， 1990（2） ： 20- 27.

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[7]萬志兵，管宏偉，張新葉， 等.楊樹銹菌種和生理小種鑒別方法評述[J].林業(yè)科技開發(fā)，2012，26（6）：9-12.endprint