何小靜，王彥潔，王 宇，楊 欣，李曉冬

0 引 言

冠心病是全球更年期婦女最主要的死亡原因，絕經(jīng)前婦女動脈粥樣硬化的發(fā)生率及冠心病的發(fā)病率和病死率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同齡男性。而這種性別優(yōu)勢隨著絕經(jīng)后年齡增加、雌激素水平的降低而慢慢變小或隨之消失［1-2］。雌激素用來防治以動脈粥樣硬化病變?yōu)榛A(chǔ)的心血管疾病已成為近年來的熱點(diǎn)。2013 年全球國際絕經(jīng)協(xié)會共識明確指出使用標(biāo)準(zhǔn)劑量的雌激素可降低60 歲以下絕經(jīng)10 年以內(nèi)的女性心血管疾病的發(fā)病率及病死率［3］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、折疊和寡聚化［4］。多種因素導(dǎo)致生理?xiàng)l件改變時(shí)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積聚，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，這種狀態(tài)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。過度或持續(xù)時(shí)間較長的刺激引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失調(diào)，觸發(fā)凋亡進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。近年來多項(xiàng)研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其引起的細(xì)胞凋亡參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，并在動脈粥樣硬化及斑塊破裂中發(fā)揮了重要的作用。雌激素作為一種女性性激素，已被證明可以通過擴(kuò)張血管、促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)增生、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等發(fā)揮血管保護(hù)作用［5-7］。

然而，雌激素是否通過阻止ERS 引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制目前還不清楚。衣霉素可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)N 一端糖基化，干擾蛋白質(zhì)合成;二硫蘇糖醇是一種強(qiáng)還原劑，能夠打開蛋白質(zhì)內(nèi)二硫鍵，抑制蛋白的折疊。兩者都能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白積聚，誘發(fā)細(xì)胞ERS，是經(jīng)典的研究藥物。Kim 等［8］采用衣霉素誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)上調(diào)，ERS 凋亡相關(guān)蛋白CHOP 和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2"terminal kinase，JNK)活化，成功創(chuàng)建了衣霉素誘導(dǎo)HUVEC ERS 的模型。

1 材料與方法

1.1 材料 人類內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926 由北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。17-β 雌二醇，ICI182，780 和hochest 染色33342 購自美國Sigma-Aldrich 公司。衣霉素和G15 購自美國Tocris Bioscience 公司。二硫蘇糖醇購自美國Amresco 公司。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素和胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司。抗CHOP、抗caspase-12 和抗GRP78 抗體購自美國Santa Cruz 公司及Abcam 公司。內(nèi)參β-actin 抗體和蛋白質(zhì)marker 購自美國Proteintech 公司。其他提取蛋白試劑購自中國Beyotime，Applygen 和ZSGB-BIO 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 選用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，常規(guī)加入100 μg/mL 青鏈霉素置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中，每2 天更換培養(yǎng)基，當(dāng)生長融合至70%～80%時(shí)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞更換為含1%FBS的DMEM，饑餓24 h 使細(xì)胞生長同步化。實(shí)驗(yàn)前期已確定10 μmol/L 衣霉素處理細(xì)胞10 h 或2 mmol/L二硫蘇糖醇處理細(xì)胞8 h 為誘導(dǎo)細(xì)胞ERS 凋亡最佳濃度和時(shí)間，而10-8mol/L 的17-β 雌二醇對ERS 的保護(hù)作用最明顯。根據(jù)是否用衣霉素/二硫蘇糖醇，雌激素，雌激素拮抗劑(ICI182，780 和G15)處理進(jìn)行如下分組:①空白對照A、B 組;②衣霉素/二硫蘇糖醇組:10 μmol/L 衣霉素誘導(dǎo)HUVECs 10 h或2 mmol/L 二硫蘇糖醇誘導(dǎo)8 h;③衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組:10-8mmol/L 17-β 雌二醇預(yù)處理1 h，后加入衣霉素/二硫蘇糖醇處理，濃度和時(shí)間同衣霉素/二硫蘇糖醇組;④衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI 組;⑤衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+G15 組;⑥衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β雌二醇+ICI+G15 組，后3 組均加10-7mmol/L 雌二醇拮抗劑預(yù)處理0.5 h，后加含17-β 雌二醇的DMEM培養(yǎng)1 h，最后按衣霉素/二硫蘇糖醇組處理相應(yīng)時(shí)間。所有組別細(xì)胞最后用胰蛋白酶處理離心后獲得。

1.2.2 Western blot 檢測 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，加入60 μL 的蛋白裂解液，于4 ℃搖床裂解30 min，4 ℃下以離心半徑10 cm，12 000 r/m 離心機(jī)離心20 min，提取總蛋白。Bradford 法測定蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量大小配置10%～15%不連續(xù)SDSPAGE 分離膠。每孔依次上樣，總蛋白樣品50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，含5%(重量/體積)脫脂奶粉封閉，抗體雜交孵育:將膜與含抗GRP78(1 ∶1000)，抗CHOP(1∶500)，抗剪切的caspase-12(1 ∶1000)的一抗于4 ℃搖床過夜。洗膜后與含辣根過氧化物酶(HRP)的二抗室溫孵育2 h，ECL 超敏發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，所有蛋白的條帶強(qiáng)度使用ImageJ軟件V1.43 通過與β-action 的密度進(jìn)行歸一化后進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 Hochest 染色 HUVECs 細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞接種密度為30%～50%融合時(shí)改變?yōu)楹?%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基饑餓，余條件同前。饑餓24 h 后用上述濃度及時(shí)間的衣霉素、二硫蘇糖醇、17-β 雌二醇及ICI1182，780 干預(yù)，然后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說明書(Sigma-Aldrich公司，美國)進(jìn)行Hochest 凋亡染色，通過熒光顯微鏡觀察凋亡狀態(tài)的細(xì)胞核。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖表制作，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用One-way ANOVA 分析，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot 蛋白分析結(jié)果 與空白對照A組比較，衣霉素組GRP78、caspase-12 和CHOP 的表達(dá)升高(P ＜0.05);與衣霉素組比較，衣霉素+17-β雌二醇組GRP78、caspase-12 和CHOP 的表達(dá)均下降(P ＜0.05);與衣霉素+17-β 雌二醇組比較，衣霉素+17-β 雌二醇+IGI 組CHOP 表達(dá)升高(P ＜0.05)，衣霉素+17-β 雌二 醇+G15 組GRP78、caspase-12 表達(dá)升高(P ＜0.05)，衣霉素+17-β 雌二醇+ICI+G15 組GRP78、caspase-12 和CHOP 的表達(dá)升高(P ＜0.05)。

與空白對照B 組比較，二硫蘇糖醇組GRP78、caspase-12 和CHOP 的表達(dá)升高(P ＜0.05);與二硫蘇糖醇組比較，二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組GRP78和CHOP 表達(dá)均下降(P ＜0.05);與二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組比較，二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI組GRP78 和CHOP 的表達(dá)升高(P ＜0.05)，二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+G15 組GRP78 表達(dá)升高(P ＜0.05)，二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI+G15 組GRP78、caspase-12 和CHOP 的表達(dá)升高(P ＜0.05)。見圖1，表1、表2。

2.2 Hochest 染色 通過Hochest 染色檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)衣霉素/二硫蘇糖醇組同一高倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對照組，衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組多個(gè)視野僅見少數(shù)細(xì)胞凋亡，數(shù)目顯著少于衣霉素/二硫蘇糖醇組，衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI 組、衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+G15 組、衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β雌二醇+ICI+G15 組凋亡細(xì)胞數(shù)均不同程度高于衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組。見圖2。

圖1 衣霉素/二硫蘇糖醇誘導(dǎo)HUVEC ERS 分子的表達(dá)Figure 1 Expression of ERS molecules induced by TM/DTT

表1 衣霉素模型組不同藥物處理組凋亡分子的灰度值，n=3)Table 1 Gray value of apoptotic molecules in TM model group treated with different drugsn=3)

表1 衣霉素模型組不同藥物處理組凋亡分子的灰度值，n=3)Table 1 Gray value of apoptotic molecules in TM model group treated with different drugsn=3)

與空白對照A 組比較，*P ＜0.05;與衣霉素組比較，#P ＜0.05;與衣霉素+17-β 雌二醇組比較，△P ＜0.05

組別GRP78 caspase12 CHOP空白對照A 組2.55±0.32 0.32±0.06 0.14±0.02衣霉素組 6.80±1.07* 1.54±0.32* 1.91±0.37*衣霉素+17-β 雌二醇組 4.01±0.46*# 0.88±0.10*# 0.91±0.02*#衣霉素+17-β 雌二醇+ICI 組 3.31±0.90* 0.72±0.08* 0.96±0.02＊△衣霉素+17-β 雌二醇+G15 組 5.25±0.80＊△ 1.02±0.07＊△ 0.63±0.04*衣霉素+17-β 雌二醇+ICI+G15 組 5.54±0.72＊△ 1.26±0.20＊△ 1.23±0.18＊△

表2 二硫蘇糖醇模型組不同藥物處理組凋亡分子的灰度值，n=3)Table 2 Gray value of apoptotic molecules in DTT model group treated with different drugs，n=3)

表2 二硫蘇糖醇模型組不同藥物處理組凋亡分子的灰度值，n=3)Table 2 Gray value of apoptotic molecules in DTT model group treated with different drugs，n=3)

與空白對照B 組比較，*P ＜0.05，與二硫蘇糖醇組比較，#P ＜0.05;二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組比較，△P ＜0.05

組別GRP78 caspase12 CHOP空白對照B 組1.18±0.05 0.73±0.05 0.18±0.05二硫蘇糖醇組 1.81±0.08* 1.10±0.16* 1.00±0.13*二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組 1.30±0.14*# 1.19±0.14* 0.51±0.01*#二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI 組 1.35±0.11＊△ 0.84±0.15* 0.56±0.06＊△二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+G15 組 1.45±0.16＊△ 1.02±0.26* 0.29±0.02*二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI+G15 組 1.66±0.71＊△ 2.04±0.66＊△ 1.10±0.10＊△

圖2 鏡下觀察不同方式處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(Hochest 染色 ×400)Figure 2 Microscopic vascular endothelial cell apoptosis were observed after treatment in different ways(Hochest staining×400)

3 討 論

流行病學(xué)資料顯示，絕經(jīng)前女性冠心病的發(fā)病率及病死率僅為同齡男性的1/10 ～3/10，但絕經(jīng)后發(fā)病率快速上升，甚至超過男性，并成為絕經(jīng)后女性死亡的首要原因，ERS 后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的細(xì)胞凋亡可能是血管動脈粥樣硬化的一個(gè)重要機(jī)制［9］。ERS 單獨(dú)存在也可促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展，雌激素作為一種類固醇激素，在體內(nèi)最具活性的形式是17β-雌二醇，也是女性絕經(jīng)前體內(nèi)最主要的雌激素形式，可減輕ERS，阻止內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞的凋亡［10-12］。

在ERS 凋亡信號通路中，GRP-78 被認(rèn)為是ERS 反應(yīng)的標(biāo)志，而caspase-12 是觸發(fā)ERS 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號通路的特異性基因［13］。當(dāng)ERS 時(shí)間過長或過度，促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP 被激活。通過激活GADD34，即翻譯起始因子eIF2a 的P-Ser51，促進(jìn)eIF2a 激酶家族激活進(jìn)而抑制逆轉(zhuǎn)錄翻譯［14］。因此，CHOP 通過增加ERS 沉默蛋白和氧化應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡。caspase-12 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，通過與caspase-7 和GRP-78 形成復(fù)合物，但過度的ERS，GRP78 將重新分配到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，在該特定域caspase-12 被裂解激活，通過細(xì)胞色素C 途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

國內(nèi)外大多研究采用衣霉素或二硫蘇糖醇建立ERS 凋亡模型［15］，本研究采用雙模型對照，結(jié)果顯示與空白對照A、B 組相比，衣霉素/二硫蘇糖醇處理組ERS 凋亡分子表達(dá)量明顯上調(diào);與衣霉素/二硫蘇糖醇組相比，衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組凋亡分子表達(dá)量降低，而加入雌激素受體拮抗劑后凋亡標(biāo)記物的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，提示衣霉素/二硫蘇糖醇成功誘導(dǎo)了ERS 模型。國際上報(bào)道雌激素對ERS 有保護(hù)作用，雌激素受體拮抗劑ICI182，780(ERα，ERβ 拮抗劑和GPER 激動劑)和G15(GPER 拮抗劑)對凋亡無顯著影響［16］。雌激素在體內(nèi)主要通過雌激素受體發(fā)揮作用，目前確定且了解較多的雌激素受體主要有3 種:ERα、ERβ 及GPER。雌激素通過ERα 和ERβ 激活包括PI3K，Akt 信號，和ERK1/2 在內(nèi)的信號通路快速起效，以上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，除JNK 增加凋亡以外，均保護(hù)細(xì)胞免受損傷。同時(shí)雌激素及其受體復(fù)合物也可通過轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因的表達(dá)，起效較為緩慢［17］。衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI+G15 組凋亡蛋白明顯高于衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇組，而衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+ICI 組、衣霉素/二硫蘇糖醇+17-β 雌二醇+G15 組凋亡蛋白表達(dá)改變呈上升趨勢，說明雌二醇通過調(diào)節(jié)其受體起到了抑制HUVEC ERS 引起的凋亡的作用，而雌激素的保護(hù)作用可能是通過ERα，ERβ和GPER 共同起調(diào)節(jié)作用，而雌激素受體后信號通路有待于進(jìn)一步研究。

Losordo 等［18］研究顯示絕經(jīng)前及絕經(jīng)后女性患者中ER 表達(dá)越豐富的冠狀動脈，發(fā)生AS 的機(jī)會越小。也有報(bào)道在女性AS 患者血管上的ER 表達(dá)明顯減少［19］，動脈粥樣硬化較為嚴(yán)重的血管對激素治療的反應(yīng)性下降。這些均提示雌激素的冠脈保護(hù)作用可能是由于PI3K/Akt 通路的激活增加和降低炎癥和細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)，一定程度上依賴于動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［20］。而雌激素通過1 個(gè)還是多個(gè)受體發(fā)揮作用，是基因型還是非基因型以及雌激素受體后信號通路目前在繼續(xù)研究中。

我們的研究結(jié)果提示雌激素能通過調(diào)節(jié)雌激素受體抑制ERS 誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。為雌激素通過調(diào)節(jié)雌激素受體保持ERS 的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而保護(hù)心血管的作用提供了新的見解。雌激素的保護(hù)作用可能是通過雌激素受體后信號通路起效的。本研究的局限性是臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性在某些方面可能不同于成人動脈內(nèi)皮細(xì)胞。

［1］ Kim ES，Menon V.Status of women in cardiovascular clinical trials［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(3):279-283.

［2］ Body mass index and cardiovascular disease risk factors in seven Asian and five Latin American centers:data from the International Clinical Epidemiology Network(INCLEN)［J］.Obes Res，1996，4(3):221-228.

［3］ Wunder D，Pache TD.The global consensus statement 2013 on menopausal hormone therapy［J］.Rev Med Suisse，2013，9(403):1950-1953.

［4］ 陳 瑜，劉翠萍，茅曉東，等.糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(11):1129-1133.

［5］ Lagranha CJ，Deschamps A，Aponte A，et al.Sex differences in the phosphorylation of mitochondrial proteins result in reduced production of reactive oxygen species and cardioprotection in females［J］.Circ Res，2010，106(11):1681-1691.

［6］ Xing D，Nozell S，Chen YF，et al.Estrogen and mechanisms of vascular protection［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(3):289-295.

［7］ Baruscotti I，Barchiesi F，Jackson EK，et al.Estradiol stimulates capillary formation by human endothelial progenitor cells:role of estrogen receptor-α/β，heme oxygenase 1，and tyrosine kinase［J］.Hypertension，2010，56(3):397-404.

［8］ Kim KM，Pae HO，Zheng M，et al.Carbon monoxide induces heme oxygenase-1 via activation of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase and inhibits endothelial cell apoptosis triggered by endoplasmic reticulum stress［J］.Circ Res，2007，101(9):919-927.

［9］ Csiszar A，Ungvari Z，Koller A，et al.Proinflammatory phenotype of coronary arteries promotes endothelial apoptosis in aging［J］.Physiol Genomics，2004，17(1):21-30.

［10］ Haas MJ，Raheja P，Jaimungal S，et al.Estrogen-dependent inhibition of dextrose-induced endoplasmic reticulum stress and superoxide generation in endothelial cells［J］.Free Radic Biol Med，2012，52(11-12):2161-2167.

［11］ Kooptiwut S，Mahawong P，Hanchang W，et al.Estrogen reduces endoplasmic reticulum stress to protect against glucotoxicity induced-pancreatic beta-cell death［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2014，139:25-32.

［12］ Fu Z，Zou F，Deng H，et al.Estrogen protects SGC7901 cells from endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by the Akt pathway［J］.Oncol Lett，2014，7(2):560-564.

［13］ 王 帥，伊 雪，鄔鵬宇，等.萊菔硫烷抗凋亡對移植大鼠心臟的保護(hù)作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(2):157-159.

［14］ Marciniak SJ，Yun CY，Oyadomari S，et al.CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum［J］.Genes Dev，2004，18(24):3066-3077.

［15］ Kyriakakis E，Philippova M，Joshi MB，et al.T-cadherin attenuates the PERK branch of the unfolded protein response and protects vascular endothelial cells from endoplasmic reticulum stressinduced apoptosis［J］.Cell Signal，2010，22(9):1308-1316.

［16］ Razandi M，Pedram A，Levin ER.Estrogen Singnals to the Preservation of Endothelial Cell From and Function［J］.J Biol Chem，2000，275(49):38540-38546.

［17］ Knowlton AA，Lee AR.Estrogen and the cardiovascular system［J］.Pharmacol Ther，2012，135(1):54-70.

［18］ Losordo DW，Kearney M，Kim EA，et al.Variable expression of the estrogen receptor in normal and atherosclerotic coronary arteries of premenopausal women［J］.Circulation，1994，89(4):1501-1510.

［19］ Nakamura Y，Suzuki T，Miki Y，et al.Estrogen receptors in atherosclerotic human aorta:inhibition of human vascular smooth muscle cell proliferation by estrogens［J］.Mol Cell Endocrinol，2004，219(1-2):17-26.

［20］ Yu HP，Hsieh YC，Suzuki T，et al.The PI3K/Akt pathway mediates the nongenomic cardioprotective effects of estrogen following trauma-hemorrhage［J］.Ann Surg，2007，245(6):971-977.