徐 鄭，竇全亮，賈瑞鵬，朱佳庚

0 引 言

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，是我國死亡率列于前10 位的腫瘤之一。膀胱癌的發(fā)病與多種因素相關(guān)，其中環(huán)境因素如吸煙［1］、接觸化工產(chǎn)品、慢性感染、一些藥物(如環(huán)磷酞胺、非那西汀等)及遺傳因素被認(rèn)為是導(dǎo)致膀胱癌的重要因素［2-4］。

研究顯示人類基因組廣泛存在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)被證實(shí)與包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)［5］。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21 ～23 nt的非編碼單鏈，進(jìn)化上高度保守。其主要通過靶向mRNA，降解靶mRNA 或從轉(zhuǎn)錄后水平抑制其翻譯，從而阻斷靶蛋白質(zhì)的形成。研究顯示miRNA 參與個(gè)體發(fā)育、器管形成、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程［6］。此外，近年來研究顯示在包括腫瘤［7］、心血管系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生過程中均可以觀察到miRNA 的異常表達(dá)［8］。有研究顯示前體區(qū)的SNP 與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，其中miR-196a2 前體區(qū)rs11614913 T ＞C 多態(tài)位點(diǎn)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，miRNA-499 前體區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)rs3746444 亦被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，上述2個(gè)miRNA 前體的SNP 位點(diǎn)與中國人群中膀胱癌發(fā)生的相關(guān)性研究報(bào)道少見［9-11］。本研究擬采用病例對照探討miRNA 前體區(qū)rs3746444(miRNA-499)及rs11614913(miRNA-196a2)多態(tài)性位點(diǎn)與膀胱癌發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2010 年1 月至2013 年12 月在我院就診并經(jīng)臨床病理診斷為膀胱癌的患者283例為膀胱癌組，其中男性218 例，女性65 例，平均年齡(66.31±13.78)歲。同期選取接受健康體檢的283 人為正常對照組，其中男性217 例，女性66 例。平均年齡(65.90±13.85)歲。正常對照組經(jīng)體檢結(jié)果顯示為正常，且無泌尿系統(tǒng)疾病史?；颊呒皩φ战M研究對象均為南京及周邊地區(qū)人群，在地理分布上無差異，均為漢族。膀胱癌組與對照組性別、年齡、吸煙、飲酒等因素的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，2 組具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對象均清楚和同意該研究，并簽署知情同意書。

1.2 病理診斷 病理標(biāo)本由本院泌尿外科醫(yī)師于手術(shù)中取出，同時(shí)取周圍淋巴結(jié)與易被侵犯的遠(yuǎn)端淋巴結(jié)行病理分析，病理分析由我院病理科醫(yī)師協(xié)助完成。膀胱癌依腫瘤大小(T)、淋巴結(jié)(N)和遠(yuǎn)處部位有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(M)(TNM)對腫瘤患者進(jìn)行臨床Ⅰ～Ⅳ分期;依腫瘤細(xì)胞的分化程度進(jìn)行分級(高分化、中分化及低分化)。

1.3 基因組DNA 提取及檢測 受試者均抽取外周血3 mL，EDTA-K2抗凝，全血經(jīng)500×g 離心5 min后，去血清后在剩下的細(xì)胞中加入300 μL 人紅細(xì)胞裂解液，混勻震蕩3 min 溶解紅細(xì)胞，10 000×g 離心30 s，沉淀白細(xì)胞，-80 ℃凍存?zhèn)溆?采用GoldMag全血基因組DNA 提取試劑盒(購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司)，按照試劑盒說明書的操作步驟提取基因組DNA?；蚪MDNA 濃度和純度采用NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(購自美國Thermo公司)進(jìn)行分析。

1.4 基因分型 從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取2 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)，使用Genotyping Tools 和Massarray Assay Design 軟件(Sequenom 公司)設(shè)計(jì)待測SNP位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物(由上海英駿生物公司合成)，并對各樣本進(jìn)行2 個(gè)位點(diǎn)對應(yīng)的Massarray SNP 檢測，檢測過程依MassARRAY?分子量陣列技術(shù)工作站標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，主要過程包括:PCR 擴(kuò)增、SAP 實(shí)驗(yàn)、單堿基延伸PCR 實(shí)驗(yàn)、樹脂純化、芯片點(diǎn)樣、質(zhì)譜分析、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與整理。實(shí)驗(yàn)由陜西佰美基因股份有限公司協(xié)助完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系分析采用二元Logistic 回歸分析，以O(shè)R 及95%CI表示相對風(fēng)險(xiǎn)度。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 對照組基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2 個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，提示樣本來自一個(gè)穩(wěn)定的群體。

2.2 基因多態(tài)性位點(diǎn)與腫瘤病理特征的相關(guān)性

將膀胱癌組依腫瘤的病理特征(腫瘤分期、周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的分化程度)進(jìn)行分組。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示在不同分化程度的腫瘤分組中2 個(gè)位點(diǎn)的基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 rs11614913 及rs3746444 與膀胱癌病理參數(shù)的頻數(shù)分布［n(%)］Table 1 Frequency distribution of rs11614913，rs3746444 and clinicopathological parameters of bladder cancer n(%)

2.3 基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型的分布 2 個(gè)位點(diǎn)的基因分型分布，經(jīng)多因素Logistic 回歸分析，在調(diào)整了性別、年齡、吸煙和飲酒因素后，結(jié)果顯示rs11614913位點(diǎn)的各基因型在2 組中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.077，P ＜0.001)，其中TT 基因型在病例組中的頻率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。rs3746444 位點(diǎn)的各基因型在2 組中分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.107，P=0.078)，但回歸分析發(fā)現(xiàn)GG 基因型在病例組中分布顯著高于對照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 rs11614913 及rs3746444 多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的Logistic 回歸分析Table 2 Logistic regression analysis on the association of rs11614913 and rs3746444 to the risk of bladder cancer

3 討 論

MicroRNA 基因多態(tài)性與腫瘤的相關(guān)性已被廣泛關(guān)注，其中rs11614913(miRNA-196a2)及rs3746444(miRNA-499)2 個(gè)位點(diǎn)是近年來研究的熱點(diǎn)。在中國人群中，Yuan 等［12］對rs11614913 位點(diǎn)與肺癌的相關(guān)性進(jìn)行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs11614913 C 等位基因與肺癌的危險(xiǎn)性增加有關(guān)。此外，Hu 等［13］的研究亦發(fā)現(xiàn)rs11614913 C 等位基因與中國婦女乳腺癌的危險(xiǎn)性增加有關(guān)。本研究基于南京地區(qū)漢族人群，發(fā)現(xiàn)rs11614913 TT 基因型與膀胱癌的發(fā)生呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與上述在中國人群中其他類型腫瘤的結(jié)果相一致。Hoffman 等［14］對該多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示rs11614913C 等位基因與miR-196a2 的低表達(dá)量相關(guān)，進(jìn)而影響了其調(diào)控靶基因的能力，影響DNA 損傷后應(yīng)答的效率。此外，He 等［9］薈萃分析結(jié)果顯示，亞洲人群中rs11614913 TT 與腫瘤發(fā)生呈負(fù)相關(guān)(TT vs CC:OR=0.80，95%CI:0.73 ～0.88;TT vs CC+CT:OR=0.85，95%CI:0.80 ～0.92)。上述研究結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。

MiRNA-499 rs3746444 基因多態(tài)性與腫瘤的相關(guān)性已經(jīng)廣泛研究。薈萃分析結(jié)果顯示該位點(diǎn)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［9，11，15］;在中國人群中亦有研究發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生相關(guān)［16］;還有研究顯示該位點(diǎn)在亞洲人群中呈現(xiàn)相關(guān)性［17-18］;而在歐洲人群中未顯示有相關(guān)性［19］。此外，功能研究亦顯示miRNA-499 可以和c-MET mRNA 結(jié)合并降低其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡并抑制細(xì)胞的增殖［20］。本研究結(jié)果顯示rs3746444GG 基因型與膀胱癌的發(fā)生相關(guān)，與上述的研究結(jié)果相一致。

本研究還將膀胱癌組依腫瘤的病理特征進(jìn)行分組，對上述基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行了χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示上述2 個(gè)位點(diǎn)的基因型分布頻率在腫瘤分期、周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)端淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，在不同分化程度的腫瘤分組中2 個(gè)位點(diǎn)的基因型分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究所探討的2 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)已被證明有生物學(xué)功能，與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但與腫瘤分化的相關(guān)性還未見相關(guān)報(bào)道，因此該結(jié)果還需進(jìn)一步研究探討。此外，本研究所納入的病例數(shù)相對較少，因此進(jìn)行分化程度分組后統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)較弱，rs11614913(miRNA-196a2)及rs3746444(miRNA-499)與腫瘤分化程度相關(guān)的結(jié)論還有待于更大樣本的研究來進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)rs11614913(miRNA-196a2)及rs3746444(miRNA-499)基因多態(tài)性與膀胱癌的發(fā)生相關(guān)，2 個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與腫瘤的分化程度相關(guān)，相關(guān)分子機(jī)制還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

［1］ Strope SA，Montie JE.The causal role of cigarette smoking in bladder cancer initiation and progression，and the role of urologists in smoking cessation［J］.J Urol，2008，180(1):31-37.

［2］ Clapp RW，Jacobs MM，Loechler EL.Environmental and occupational causes of cancer:new evidence 2005-2007［J］.Rev Environ Health，2008，23(1):1-37.

［3］ 程 文，徐 鋒，刑瀟瀟，等.310 例膀胱癌綜合治療病例的臨床分析［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(12):1282-1285.

［4］ 楊德林，霍 倩，王乙水，等.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 及其受體CXCR4 對膀胱癌細(xì)胞侵襲能力及腔內(nèi)種植的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(10):1028-1032.

［5］ Wojcicka A，de la Chapelle A，Jazdzewski K.MicroRNA-related sequence variations in human cancers［J］.Hum Genet，2014，133(4):463-469.

［6］ 江勝林，凌秀風(fēng)，張軍強(qiáng).MicroRNAs 在早期胚胎發(fā)育中的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，24(4):746-749.

［7］ Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(4):259-269.

［8］ 吳彩云，張春妮.MicroRNA 與神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(7):746-750

［9］ He B，Pan Y，Cho WC，et al.The association between four genetic variants in microRNAs(rs11614913，rs2910164，rs3746444，rs2292832)and cancer risk:evidence from published studies［J］.PLoS One，2012，7(11):e49032.

［10］ Wang P，Xie S，Cui A，et al.miR-196a2 polymorphisms and susceptibility to cancer:A meta-analysis involving 24，697 subjects［J］.Exp Ther Med，2012，3(2):324-330.

［11］ Wang F，Sun G，Zou Y，et al.Association of microRNA-499 rs3746444 polymorphism with cancer risk:evidence from 7188 eases and 8548 controls［J］.PLoS One，2012，7(9):e45042.

［12］ Yuan Z，Zeng X，Yang D，et al.Effects of common polymorphism rs 11614913 in Hsa-miR-196a2 on lung cancer risk［J］.PLoS One，2013，8(4):e616047.

［13］ Hu Z，Liang J，Wang Z，et al.Common genetic variants in premicroRNAs were associated with increased risk of breast cancer in Chinese women［J］.Hum Mutat，2009，30(1):79-84.

［14］ Hoffman AE，Zheng T，Yi C，et al.MicroRNA miR-196a-2 and breast cancer:a genetic and epigenetic association study and Functional analysis［J］.Cancer Res，2009，69(14):5970-5977.

［15］ Wang Y，Yang B，Ren X.Hsa-miR-499 polymorphism(rs3746444)and cancer risk:a meta-analysis of 17 case-control studies［J］.Gene，2012，509(2):267-272.

［16］ Xiang Y，F(xiàn)an S，Cao J，et al.Association of the microRNA-499 variants with susceptibility to hepatocellular carcinoma in a Chinese population［J］.Mol Biol Rep，2012，39(6):7019-7023.

［17］ Qiu MT，Hu JW，Ding XX，et al.Hsa-miR-499 rs3746444 polymorphism contributes to cancer risk:a meta-analysis of 12 studies［J］.PLoS One，2012，7(12):e50887.

［18］ Chen P，Zhang J，Zhou F.MiR-499 rs3746444 polymorphism is associated with cancer development among Asians and related to breast cancer susceptibility［J］.Mol Biol Rep，2012，39(12):10433-10438.

［19］ Wang L，Qian S，Zhi H，et al.The association between hsamiR-499 T ＞C polymorphism and cancer risk:a meta-analysis［J］.Gene，2012，508(1):9-14.

［20］ Buurman R，Gürlevik E，Sch?ffer V，et al.Histone deacetylases activate hepatocyte growth factor signaling by repressing microRNA-449 in hepatocellular carcinoma cells［J］.Gastroenterology，2012，143(3):811-820.