杭 華,鮑士寶,王 波,周守標(biāo),江 波

(1.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,安徽蕪湖 241003;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

填充床反應(yīng)器固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化合成雙果糖酐Ⅲ的研究

杭 華1,鮑士寶1,王 波1,周守標(biāo)1,江 波2

(1.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,安徽蕪湖 241003;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

本文建立了填充床反應(yīng)器固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶水解菊糖的工藝。以菊糖為底物,探究該工藝水解菊糖的條件,以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,考察菊糖濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及底物流速等因素對(duì)雙果糖酐Ⅲ含量的影響,獲得最佳的工藝條件。該工藝采用填充床反應(yīng)器的容積為20mL,固定化酶的裝載量為15mL。結(jié)果表明:菊糖濃度為100g/L,反應(yīng)時(shí)間為1h,溫度為60℃,底物流速為20mL/h,在該工藝條件下制取雙果糖酐Ⅲ的濃度為67.38g/L。該工藝能持續(xù)操作48d以上,半衰期為48d,為該工藝大規(guī)模生產(chǎn)提供理論與操作的基礎(chǔ)。

雙果糖酐Ⅲ,固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶,正交實(shí)驗(yàn),穩(wěn)定性

菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(EC4.2.2.18,Inulin fructotransferase,縮寫(xiě)為IFTase)能水解菊糖生成雙果糖酐Ⅲ(即DFA Ⅲ)。DFA Ⅲ是低甜度與低熱量的新型甜味劑,其生理功能具有增進(jìn)骨骼的鈣吸收、利于排尿、提高礦物質(zhì)和黃酮類(lèi)化合物的吸收、預(yù)防結(jié)腸癌及抑制蛀牙等,因而其能廣泛地應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。DFA Ⅲ利用微生物產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化水解菊糖來(lái)制備,已發(fā)現(xiàn)10余種微生物(主要為節(jié)桿菌屬)可以產(chǎn)生此酶[2]。DFA Ⅲ主要是采用IFTase酶直接水解菊糖進(jìn)行制備,利用微生物產(chǎn)IFTase酶水解菊糖。IFTase游離酶水解制取DFA Ⅲ的問(wèn)題是耗時(shí)且勞動(dòng)強(qiáng)度大,參與反應(yīng)的催化劑酶無(wú)法重復(fù)利用而造成浪費(fèi),產(chǎn)物的產(chǎn)率低,反應(yīng)結(jié)束后需要高溫或調(diào)pH來(lái)使酶失活,能量消耗大等不利方面。固定化酶具有重復(fù)利用、易回收及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用較為廣泛。目前,采用固定化酶的方法制備雙果糖酐Ⅲ的報(bào)道較少,Kazutomo Haraguchi[3]等報(bào)道Chitopearl BCW3510結(jié)合戊二醛固定化IFTase酶,重復(fù)利用8次酶活力損失少;Ulrich Jahnz[4]等報(bào)道利用海藻酸鹽結(jié)合殼聚糖與戊二醛包埋IFTase表達(dá)酶具有較好的耐熱性,其適合于重復(fù)利用。海藻酸鹽包埋固定化酶已經(jīng)應(yīng)用于塔格糖制備[5]、氯仿降解[6]、低聚果糖的工業(yè)化制取[7]等。采用填充床反應(yīng)器固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化制取DFA Ⅲ,其反應(yīng)條件溫和、固定化酶反復(fù)利用及利于產(chǎn)物制備。本研究以菊糖為底物,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn);在此基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化對(duì)填充床反應(yīng)器固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化水解菊糖的因素進(jìn)行探究,獲得最佳的操作工藝

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃節(jié)桿菌 江南大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;菊糖 上海譜振生物科技有限公司;雙果糖酐Ⅲ 日本大阪光純化學(xué)工業(yè)公司;海藻酸鈉、明膠及其他試劑 均為分析純,中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;冷凍離心機(jī)、電子天平 上海精密儀器有限公司;高效液相色譜 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于金黃節(jié)桿菌,將金黃節(jié)桿菌的發(fā)酵液離心,除去菌體,保留上清液即為粗酶液。采用超濾方法除去上清液中的小分子雜質(zhì),濃縮液即為簡(jiǎn)易純化酶,低溫保藏用于固定化酶。

1.2.2 酶的固定化 將海藻酸鈉和明膠分別在60℃預(yù)先保溫溶解,3mL IFTase酶液(酶活約為300U/mL)與6mL海藻酸鈉溶液充分混合攪拌,再加入3mL明膠溶液,混合乳化30～40min(50℃)。用注射器混合液滴入氯化鈣液中,形成均一光滑的顆粒,0～4℃條件下靜置硬化4～6h。將獲得顆粒用生理鹽水和去離子水洗滌,抽濾干燥即得固定化酶,顆粒狀固定化酶的直徑約5mm,機(jī)械強(qiáng)度較好,酶的比活力為68.4U/g(酶活/固定化酶濕重),保存于0～4℃條件下待用。

1.2.3 固定化酶反應(yīng)器水解菊糖的持續(xù)操作 持續(xù)的固定化酶填充床反應(yīng)器包括:雙層玻璃柱和固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶。持續(xù)反應(yīng)器系統(tǒng)的示意圖,見(jiàn)圖1。通過(guò)循環(huán)水浴加熱,填充床反應(yīng)器維持適宜的反應(yīng)溫度。從反應(yīng)器底部通入一定流速的底物,便于反應(yīng)器操作,盡可能減少固定化酶自身擠壓而導(dǎo)致堵塞問(wèn)題。

圖1 填充床反應(yīng)器固定化酶持續(xù)水解菊糖的示意圖Fig.1 The diagram of bed reactor with immobilized enzyme for continuous inulin hydrolysis

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.2酶的固定化方法,制取固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶,將其裝入流化床反應(yīng)器。探究影響固定化酶填充床反應(yīng)器催化水解菊糖的因素:菊糖濃度(m/V)為20～120g/L,流速為5～30mL/h,溫度為30～90℃,反應(yīng)時(shí)間為0～1.5h。反應(yīng)產(chǎn)物主要有DFA Ⅲ與較少量低聚果糖等。樣品收集分析之前,依據(jù)每個(gè)流速達(dá)到穩(wěn)定態(tài)的保留時(shí)間,反應(yīng)器平衡2～10h。采用HPLC檢測(cè),研究酶催化水解菊糖生成DFA Ⅲ含量。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 在上述反應(yīng)因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇菊糖濃度(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)與底物流速(D)4個(gè)因素為自變量,設(shè)計(jì)了一個(gè)4因素3個(gè)水平的正交實(shí)驗(yàn),各因素依據(jù)表1,設(shè)定主要考察指標(biāo)為DFA Ⅲ含量(Y),分析研究影響填充床固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化制備DFA Ⅲ含量的主要因素。

表1 正交實(shí)驗(yàn)分析因素與水平

1.2.4 高效液相色譜分析方法 樣品采集:依據(jù)1.2.3收集到樣品,20g/L菊糖濃度的產(chǎn)物不需要稀釋,其他濃度菊糖產(chǎn)物按照菊糖濃度與20g/L菊糖濃度的比例進(jìn)行稀釋。采集的樣品過(guò)0.22μm纖維素膜后取10μL進(jìn)HPLC(高效液相色譜)分析。

1.2.5 高效液相色譜分析條件 HPLC檢測(cè)條件:糖柱(Waters Sugur-PakTM1,6.5×300mm);流動(dòng)相,超純水;示差折光檢測(cè)器(Shodex RI101);柱溫,80℃;流速,0.4mL/min;進(jìn)樣量,10μL。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 本文中,實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次操作,統(tǒng)計(jì)數(shù)值并計(jì)算平均值,平均值表示實(shí)驗(yàn)數(shù)值,誤差棒表示實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)值的誤差。應(yīng)用Origin 7.5軟件(美國(guó)OriginLab 中國(guó)分公司,中國(guó)廣州)來(lái)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菊糖水解產(chǎn)物的HPLC圖譜

依據(jù)1.2.4的HPLC分析方法,IFTase催化水解菊糖的產(chǎn)物為DFA Ⅲ以及少量的低聚果糖,見(jiàn)圖2。由圖可以看出,未反應(yīng)菊糖出峰時(shí)間為6.394min,低聚果糖(蔗果四糖、蔗果三糖、蔗果二塘)的出峰時(shí)間分別為7.197、7.643及8.372min,DFA Ⅲ出峰時(shí)間為9.748min。菊糖轉(zhuǎn)化率(生成DFA Ⅲ)能達(dá)到80%。

圖2 菊糖水解產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.2 HPLC scheme of inulin hydrolysis products

2.2 反應(yīng)因素的確定

2.2.1 菊糖濃度的影響 依據(jù)1.2.3.1方法,在反應(yīng)溫度為60℃、反應(yīng)時(shí)間為1h與底物流速為20mL/h的條件下,研究DFA Ⅲ得率與菊糖濃度的關(guān)系,見(jiàn)圖3。由圖3可知,底物菊糖濃度由20～80g/L,DFA Ⅲ含量變化不大;當(dāng)菊糖濃度大于80g/L時(shí),DFA Ⅲ含量降低較為顯著。菊糖濃度為20、40、60、80、100、120g/L時(shí),DFA Ⅲ含量分別為16.7、32.8、48.9、64.6、78.4、90.2g/L。隨著菊糖濃度的升高,DFA Ⅲ含量也逐漸提高,反應(yīng)進(jìn)程符合酶反應(yīng)方程動(dòng)力學(xué),底物濃度的增加會(huì)促使反應(yīng)向產(chǎn)物濃度增加的方向進(jìn)行。然而,隨著底物濃度的持續(xù)升高,因高濃度底物對(duì)酶具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,菊糖轉(zhuǎn)化效率(即酶的催化效率)降低。綜合考慮上述影響因素,選擇菊糖的濃度為80g/L。

圖3 菊糖濃度與DFA Ⅲ得率的關(guān)系Fig.3 Relations of inulin concentration and DFA Ⅲ yield

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的影響 依據(jù)1.2.3.1方法,在反應(yīng)溫度為60℃、底物濃度為80g/L與底物流速為20mL/h的條件下,研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化水解反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,DFA Ⅲ濃度也逐步提高;反應(yīng)時(shí)間為60min(即1h)時(shí),DFA Ⅲ含量基本保持不變,反應(yīng)達(dá)到平衡。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),DFA Ⅲ濃度增加趨于平衡,考慮到反應(yīng)成本、時(shí)間及DFA Ⅲ含量等因素,選擇反應(yīng)時(shí)間為1h。

圖4 反應(yīng)時(shí)間與DFA Ⅲ含量的關(guān)系Fig.4 Relations of reaction time and DFA Ⅲ content

2.2.3 溫度的影響 依據(jù)1.2.3.1方法,在反應(yīng)時(shí)間為1h、底物濃度為80g/L與底物流速為20mL/h的條件下,研究反應(yīng)溫度對(duì)酶催化水解反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出,隨著反應(yīng)溫度的升高,DFA Ⅲ含量也逐步提高;當(dāng)溫度為60℃時(shí),DFA Ⅲ含量達(dá)到平衡;溫度繼續(xù)升高,DFA Ⅲ含量增加緩慢;溫度過(guò)高,DFA Ⅲ含量出現(xiàn)下降趨勢(shì),表明溫度是影響酶催化水解的主要因素之一?？紤]持續(xù)實(shí)驗(yàn)中酶活力下降及溫度等的影響,依據(jù)酶的耐受溫度范圍及升高溫度增加酶催化水解效率,選擇反應(yīng)溫度為60℃。

圖5 反應(yīng)溫度與DFA Ⅲ含量的關(guān)系Fig.5 Relations of reaction temperature and DFA Ⅲ content

2.2.4 底物流速的影響 依據(jù)1.2.3.1方法,在反應(yīng)時(shí)間為1h、反應(yīng)溫度為60℃與底物濃度為80g/L的條件下,研究底物流速對(duì)酶催化水解反應(yīng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可以看出,當(dāng)?shù)孜锪魉贋?～20mL/h時(shí),隨著底物流速的增加,DFA Ⅲ含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì);當(dāng)流速大于20mL/h時(shí),DFA Ⅲ含量下降加快,說(shuō)明流速過(guò)快,底物與酶反應(yīng)不完全,酶的催化水解效率降低。底物流速適當(dāng)?shù)卦黾?能提高單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的含量;因此,選擇底物流速為20mL/h。

圖6 底物流速與DFA Ⅲ含量的關(guān)系Fig.6 Relations of substrate velocity and DFA Ⅲ content

2.3 DFA Ⅲ制備條件的正交優(yōu)化

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2所示,影響酶活的因素依次為B>D>A>C;獲取DFA Ⅲ含量最高的組合為A3B2C2D1,通過(guò)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn),獲得DFA Ⅲ含量為68.62g/L。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,底物流速的提高可以增加單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物量,這對(duì)于實(shí)際應(yīng)用具有重要意義,采用A3B2C2D2進(jìn)行實(shí)驗(yàn),獲得DFA Ⅲ含量為67.38g/L。因此,確定流化床反應(yīng)器固定化酶水解菊糖的操作條件為:菊糖濃度為100g/L,反應(yīng)時(shí)間為1h,反應(yīng)溫度為60℃及底物流速為20mL/h。

表2 流化床反應(yīng)器固定化酶操作條件的正交實(shí)驗(yàn)

2.3.2 填充床反應(yīng)器的操作穩(wěn)定性 在上述研究的基礎(chǔ)上,探究填充床反應(yīng)器的操作穩(wěn)定性。操作的優(yōu)化條件:菊糖濃度為100g/L,反應(yīng)溫度為60℃,底物流速為20mL/h。利用HPLC檢測(cè)并計(jì)算菊糖水解液中DFA Ⅲ的含量與相對(duì)酶活的變化。由圖7可知,持續(xù)操作3d,獲得DFA Ⅲ的含量為67.38g/L且?guī)缀蹙S持不變;持續(xù)操作8d,獲得DFA Ⅲ的含量為62.57g/L;持續(xù)操作40d,獲得DFA Ⅲ的含量為41.32g/L,反應(yīng)器持續(xù)操作48d后,獲得獲得DFA Ⅲ的含量為34.21g/L。由圖8可以看出,首次用于催化水解菊糖的固定化酶相對(duì)酶活為100%,隨著操作時(shí)間的增加,相對(duì)酶活逐漸降低;反應(yīng)器持續(xù)操作48d,相對(duì)酶活降低至50%。綜上所述,填充床反應(yīng)器持續(xù)操作的半衰期為48d。

圖7 操作時(shí)間與DFA Ⅲ含量的關(guān)系Fig.7 Relations of operation time and DFA Ⅲ content

圖8 相對(duì)酶活與操作時(shí)間的關(guān)系Fig.8 Relations of operational time and relative enzyme activity

3 結(jié)論

本文建立了填充床反應(yīng)器固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶持續(xù)水解菊糖制取DFA Ⅲ的操作系統(tǒng),該系統(tǒng)的容積為20mL,固定化酶的裝載量為15mL。探討了該系統(tǒng)進(jìn)行菊糖濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物流速等單因素實(shí)驗(yàn);在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)軟件分析菊糖濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物流速等因素對(duì)制取DFA Ⅲ的影響,優(yōu)化確定填充床反應(yīng)器固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶催化水解菊糖的最適工藝條件:菊糖濃度為100g/L,反應(yīng)時(shí)間為1h,反應(yīng)溫度為60℃,底物流速為20mL/h。該操作系統(tǒng)的持續(xù)進(jìn)行48d,DFA Ⅲ的含量由62.57g/L減少至34.21g/L,相對(duì)酶活降低至初始固定化相對(duì)酶活的一半,該操作系統(tǒng)的半衰期為48d。

[1]趙萌,沐萬(wàn)孟,張濤,等. 新型食品添加劑雙果糖酐Ⅲ的研究發(fā)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(8):123-126.

[2]Hang H,Mu W,Jiang B,et al. Recent advances on biological difructose anhydride Ⅲ production using inulase II from inulin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2011,92:457-465.

[3]Haraguchi K,Ohtsobo K. Production and immobilization of thermostable oligosaccharide DFA Ⅲ producing enzyme fromArthrobactersp. L68-1[J]. National Food Res Inst,2004,68:19-24.

[4]Jahnz U,Schubert M,Baars-Hibbe H,et al. Process for producing the potential food ingredient DFA Ⅲ from inulin:screening,genetic engineering,fermentation and immobilization of inulase II[J]. Intern J Pharm,2003,256:199-206.

[5]Aleksandra M,Natasa B,Zoran V. Cell wall invertase immobilization within calcium alginate beads[J]. Food Chemistry,2007,104:81-86.

[6]Kaushik D,Pranab R. Degradation of chloroform by immobilized cells ofBacillussp. In calcium alginate beads[J]. Biotechnology Letter,2011,33(6):1101-1106.

[7]Jung KH,Bang SH,Oh TK,et al. Industrial production of fructooligosaccharides by immobilized cells of Aureobasidium pullulans in a packed bed reactor[J]. Biotechnology Letter,2011,33(8):1621-1624.

Study on the process of bed reactor with immobilized inulin fructotransferase for catalytic synthesis of DFA Ⅲ

HANG Hua1,BAO Shi-bao1,WANG Bo1,ZHOU Shou-biao1,JIANG Bo2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Anhui Normal University,Wuhu 241003,China;2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The process of bed reactor with immobilized inulin fructotransferase for inulin hydrolysis was founded. The conditions of inulin hydrolysis were explored. Based on single factors experiments,orthogonal experiment was adopted to investigate the influences of inulin concentration,reaction time,reaction temperature and substrate velocity on DFA Ⅲ contents. The optimal conditions were obtained. This process was adopted with the volume of packed bed reactor for 20mL and loading amount of immobilized enzyme for 15mL. The best results were attained with inulin concentration 100g/L,reaction time 1h,reaction temperature 60℃ and substrate velocity 20mL/h. DFA Ⅲ concentration was 67.38g/L at the conditions of this process. The process could continue to operate over 48 days. The half-life of operation was 48 days. The foundation was provided for the theory and operation of mass production.

difructose anhydride Ⅲ;immobilized inulin fructotransferase;orthogonal experiment;stability

2014-06-25

杭華(1977-),男,博士,講師,研究方向:食品生物新技術(shù)。

2013年校項(xiàng)目培育基金項(xiàng)目(160-71361);安徽師范大學(xué)12博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(161-070110)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)07-0192-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.032