劉 賓,李媛媛,王曉明,曹鳳波,霍貴成,楊麗杰

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細(xì)胞增殖和遷移的影響

劉 賓,李媛媛,王曉明,曹鳳波,霍貴成,楊麗杰*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

本文探討牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細(xì)胞生長和遷移的作用,為治療人類胃腸炎癥提供一種安全可靠的方法。給予CaCO-2細(xì)胞一定劑量的牛初乳生長因子粗提物,通過MTT法,分別測定12、24、36h細(xì)胞的增殖率;用BCA試劑測定CaCO-2總蛋白質(zhì)含量;用劃線法測定細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明:與對照組相比,細(xì)胞增殖率與牛初乳生長因子粗體物有劑量依懶性。培養(yǎng)12h時(shí),100ng/mL牛初乳生長因子即能顯著刺激細(xì)胞增殖,達(dá)到16.3%(p<0.05),1μg/mL時(shí),有最大的增殖率20.6%;培養(yǎng)24,36h時(shí),1μg/mL牛初乳生長因子粗提物對細(xì)胞有最大增殖率,分別達(dá)到30.8%和40.0%,但是此時(shí)顯著低于10%胎牛血清對細(xì)胞的增殖率;細(xì)胞蛋白質(zhì)和遷移速度也與牛初乳生長因子粗提物濃度呈現(xiàn)劑量依懶性關(guān)系,在10μg/mL時(shí),達(dá)到最大含量和遷移速度;本研究證實(shí)牛初乳生長因子粗提物能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,蛋白質(zhì)含量增加和細(xì)胞遷移速度。

初乳,生長因子,增殖,遷移

牛初乳是指奶牛分娩后7d內(nèi)特別是3d內(nèi)所分泌的乳汁。初乳中不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及免疫球蛋白,還含有大量的生長因子,特別是泌乳后2d內(nèi)[1]。隨著泌乳時(shí)間延長,3～4d后初乳中的生長因子水平已經(jīng)趨近于常乳。

牛初乳是自然界中唯一含有兩類主要生長因子(類胰島素生長因子(IGF-Ⅰ,Ⅱ)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1,β2))的天然產(chǎn)物[2],而且IGF-Ⅰ和TGF-β2也是初乳中含量最高的兩種生長因子,EGF只在分泌初期含量較多[3]。初乳還含有其他生長因子,如血小板生長因子(PDGF)、上皮生長因子(EGF)、成纖維生長因子(FGF)等。它們主要刺激表皮、上皮和胚胎細(xì)胞的增殖,抑制胃酸分泌,促進(jìn)傷口愈合和骨吸收,在胚胎發(fā)生、組織修復(fù)、骨和結(jié)締組織形成以及免疫控制中起重要作用[4]。IGF-Ⅰ與胃腸粘膜細(xì)胞酪氨酸激酶受體結(jié)合,使腸黏膜細(xì)胞生長和增殖,腸絨毛高度增加,促進(jìn)小腸發(fā)育[5]。另外,研究發(fā)現(xiàn)IGF-I除能促進(jìn)腸細(xì)胞生長外,還能刺激腸道組織中IgA的mRNA表達(dá)水平的提高,以維持腸道黏膜液層的功能[6]。表皮生長因子能夠刺激表皮、上皮和胚胎細(xì)胞增殖,且無種屬特異性,還能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、鳥苷酸脫氧核糖的合成以及細(xì)胞外大分子的合成。在小腸和結(jié)腸修復(fù)時(shí),EGF能減少隱窩分裂,增加其增殖[7]。有研究證實(shí)從乳清中去除β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和乳鐵蛋白,剩余成分比胎牛血清有更強(qiáng)的促細(xì)胞生長作用,對許多細(xì)胞系有增殖作用,這表明除常規(guī)營養(yǎng)成分外,促細(xì)胞生長作用歸于其中的生長因子。但是Belford U[8-9]等研究發(fā)現(xiàn)TGF-β2能夠抑制上皮細(xì)胞的分裂,由于其在初乳和初乳乳清中還有很高濃度的IGF-Ⅰ,Ⅱ及其結(jié)合蛋白,而且牛初乳中還含有其他促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子EGF,PDGF,FGF-2及含有結(jié)合蛋白[10-12],提取的促有絲分裂提取物仍有很強(qiáng)促細(xì)胞增殖的效果。

現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快,飲食不規(guī)律,胃腸病發(fā)生率越來越高,日常生活中人們幾乎都會不同程度地發(fā)生急性或慢性胃腸病。數(shù)據(jù)顯示我國有近30%的人患有各種胃炎,目前全國胃病患者的總?cè)藬?shù)粗略估計(jì)就有近4億人,而且其中40%病情嚴(yán)重。乳源生長因子預(yù)防和治療這些疾患顯現(xiàn)出巨大的潛能,不僅來源廣泛,而且安全有效。而且應(yīng)用乳源生長因子代替胎牛血清,用于細(xì)胞工程也具有很大的潛力。單一生長因子對傷口愈合,胃腸炎治療,細(xì)胞增殖都已經(jīng)被驗(yàn)證。Simat Siti Fatimah[13]等證實(shí)表皮生長因子(EGF)能調(diào)節(jié)人羊膜上皮細(xì)胞循環(huán)周期,顯著增加S-和G2/M細(xì)胞比例,促進(jìn)細(xì)胞增殖,Igor Sukhotnik[14]等證實(shí)轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)能夠修復(fù)和改善由氨甲喋呤引起的大鼠腸損傷,顯著增加空腸和回腸腸、黏膜的重量,DNA、蛋白質(zhì)的含量以及絨毛的長度,呂劍光[15]等研究牛初乳胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)對氨甲喋呤引起大鼠腸損傷的影響,證實(shí)IGF-Ⅰ能夠明顯修復(fù)大鼠腸道損傷,降低因腸道損傷而大量產(chǎn)生的二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量。幾種生長因子協(xié)同對上皮細(xì)胞增殖和遷移的作用仍然是未知的。本實(shí)驗(yàn)主要是以CaCO-2為模型,研究從牛初乳中提取的生長因子提取物對CaCO-2細(xì)胞增殖和遷移方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳 由黑龍江完達(dá)山松北牧場提供;凝乳酶 由丹尼斯特(中國)有限公司提供;胰蛋白酶 購自北京索萊寶科技有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)液 購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;CaCO-2 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;胎牛血清(FBS) 購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、細(xì)胞裂解液 購自青島海泰生物技術(shù)有限公司。

JC10-NN3MT-100乳成分分析儀 北京北信科儀分析儀器有限公司;低速離心機(jī)LD4-2 北京醫(yī)用離心機(jī);300ku陶瓷膜超濾儀 北京華創(chuàng)源泉環(huán)境技術(shù)有限公司;100、30ku超濾離心管 上海艾研生物科技有限公司;HF90型CO2培養(yǎng)箱 香港力康發(fā)展有限公司;潔凈工作臺VD-1320 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;AE-30型倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;6孔板、96孔板 北京欣源佳和生物科技有限公司;Model 680型酶標(biāo)儀 美國Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛乳基本成分的測定 將分娩后2d內(nèi)的牛初乳和常乳置于水浴鍋中恒溫至25℃,上機(jī)測定奶樣成分。

1.2.2 牛初乳中生長因子粗提物的提取 將健康母牛分娩后2d內(nèi)的牛初乳,過濾除雜,離心脫脂(7000r/min,15min,4℃),小心地取出上層脂肪,將脫脂乳控溫至37℃,邊攪拌邊緩慢加入凝乳酶(效價(jià)1萬,添加量0.1%),37℃保溫凝乳,凝乳后將乳塊破碎,在8000r/min,4℃下離心20min,收集乳清[16]。用陶瓷膜超濾儀除去乳清中大于300ku的大分子物質(zhì),然后將濾出的清液分別依次用100、30ku的超濾離心管離心(4000×g,15min,4℃),收集最后的清液。

將所得的提取液進(jìn)行脫鹽處理,采用3500u的透析袋,吸水劑為聚乙烯吡咯,將所得產(chǎn)物冷凍干燥后貯存,即為生長因子粗提物。

1.2.3 MTT法測定初乳生長因子對CaCO-2促增殖作用 將處于對數(shù)生長期的CaCO-2細(xì)胞,用胰蛋白酶消化,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度約為1×105/mL,以每孔100μL加入96孔培養(yǎng)板。將牛初乳生長因子提取物配制成1mg/mL,作為母液,用無血清的DMEM配制成100、10、1μg/mL、100、10、1ng/mL梯度濃度的實(shí)驗(yàn)溶液。培養(yǎng)24h后,吸取培養(yǎng)液,加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)溶液100μL,空白對照組加無血清培養(yǎng)基,含10% FBS的培養(yǎng)基為陽性對照組。細(xì)胞在37℃,5%二氧化碳狀態(tài)下分別培養(yǎng)24、36和48h后,每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)20μL。繼續(xù)37℃孵育4h后,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL,震蕩10min。于酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長檢測OD值,并計(jì)算增殖率。初乳生長因子對CaCO-2細(xì)胞的促生長作用以CaCO-2細(xì)胞增殖率來衡量,計(jì)算公式:

細(xì)胞增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A對照組)/A對照組×100

1.2.4 牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2蛋白質(zhì)含量的影響 用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液將密度為5×104個/mL細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞匯合程度達(dá)到60%時(shí),換用無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,使其同步化。棄去原培養(yǎng)液,添加100、10、1μg/mL、100、10ng/mL的生長因子粗提取物,空白用無血清DMEM細(xì)胞組做對照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。用4℃的PBS沖洗3遍,每瓶加入0.5mL含0.1%的Trition細(xì)胞裂解液,置于-20℃和4℃條件下,反復(fù)凍融30min。將各組蛋白溶液轉(zhuǎn)移到96孔板中,每組20μL,加入BCA(bicinchonininc acid)法蛋白測定液100μL,震蕩10min,測定570nm條件下的OD值。

1.2.5 牛初乳生長因子對CaCO-2遷移的影響 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將CaCO-2細(xì)胞接種到24孔板中,每孔1mL,待細(xì)胞鋪滿底層板時(shí),換用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,使其同步化,用嚴(yán)格滅菌的槍頭在底部劃出一條直線,并做好標(biāo)記,用PBS清洗3次,分別加入100、10、1μg/mL、100、10、1ng/mL生長因子粗提物。分別記錄0、12、24、36h的圖像,用Image plus+軟件計(jì)算遷移距離,遷移距離=劃痕0h后劃痕寬度-劃痕處理后劃痕寬度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以Means±SD表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析。以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛初乳中的基本成分

牛初乳中與常乳中的營養(yǎng)成分有明顯的區(qū)別(見表1),初乳中的脂肪和蛋白質(zhì)含量明顯高于常乳,灰分含量略微高于常乳。

表1 牛初乳基本成分的測定

2.2 牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細(xì)胞生長的影響

在培養(yǎng)12h時(shí),和對照組相比(見表2),牛初乳生長因子粗提物在1ng/mL～1μg/mL的濃度范圍內(nèi),CaCO-2細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)劑量依賴性,并且在1μg/mL時(shí),對細(xì)胞具有最大的促生長作用,與含10%胎牛血清高糖DMEM具有相似的增殖率。當(dāng)濃度再次增大時(shí),增殖率反而略有下降。

在培養(yǎng)24h時(shí),與對照組相比(見表3),牛初乳生長因子在1ng/mL～1μg/mL的濃度范圍內(nèi),仍然與CaCO-2細(xì)胞具有劑量依賴性關(guān)系,在1μg/mL時(shí),具有最大增殖率,要比對照組高出30%,但是要顯著低于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基對細(xì)胞促生長作用。隨著濃度增大,細(xì)胞增殖速率反而會略有降低。

表2 牛初乳生長因子與CaCO-2細(xì)胞的劑量效應(yīng)(12h)

注:數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。同一列數(shù)據(jù)中字母相同則表示差異不顯著(p>0.05),不同則表示差異顯著(p<0.05),表3、表4同。

表3 牛初乳生長因子與CaCO-2細(xì)胞的劑量效應(yīng)(24h)

與對照組相比(見表4),用含牛初乳生長因子粗提物的培養(yǎng)基培養(yǎng)CaCO-2細(xì)胞,36h后,牛初乳生長因子在1ng/mL～1μg/mL作用范圍內(nèi),呈現(xiàn)劑量依賴性(p<0.05),1ng/mL的牛初乳生長因子粗提物能顯著促進(jìn)CaCO-2細(xì)胞生長。在1μg/mL時(shí),具有最大促生長作用,但是增殖率要顯著低于含10%FBS的高糖DMEM對細(xì)胞的促生長作用。

表4 牛初乳生長因子與CaCO-2細(xì)胞的劑量效應(yīng)(36h)

2.3 牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2總蛋白含量的影響

細(xì)胞同步化培養(yǎng)后,經(jīng)含不同濃度牛初乳生長因子粗提物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CaCO-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)不同濃度牛初乳生長因子粗提物都能顯著促進(jìn)CaCO-2細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的增加(見圖1),且隨著濃度的增加,細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)劑量依賴性,且10ng/mL牛初乳生長因子粗提物能顯著增加細(xì)胞蛋白含量(p<0.05)。10μg/mL牛初乳生長因子粗提物較大幅度提高細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度,但是低于用含10%FBS的高糖DMEM對細(xì)胞總蛋白的作用。

圖1 不同濃度生長因子粗提取對CaCO-2總蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of growth factors extract on CaCO-2 total protein content注:與對照組相比,*p<0.05;**p<0.01。

2.4 牛初乳生長因子對CaCO-2細(xì)胞遷移的影響

與對照組細(xì)胞相比(見圖2、圖3),不同濃度牛初乳生長因子都能顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移(p<0.05)。濃度增大,遷移速度明顯加快,在10μg/mL條件下,有最大的遷移速度。在濃度大于10ng/mL時(shí),單位時(shí)間內(nèi),遷移的速度顯著快于對照組。在×40倍光鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)含有10μg/mL牛初乳生長因子粗提物組細(xì)胞的遷移速度要明顯快于100ng/mL組,更顯著快于對照組(p<0.01)。

圖2 不同濃度牛初乳生長因子對CaCO-2細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Effect of different concentrations of colostrum growth factor on CaCO-2 cells migration

圖3 不同濃度生長因子粗提物對細(xì)胞遷移的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of colostrum growth factor on CaCO-2 cells migration

2.5 討論

目前,國內(nèi)關(guān)于牛初乳生長因子粗體物對上皮細(xì)胞增殖和遷移的研究并不多,BELFORD[8]等用陽離子交換色譜層析技術(shù)從乳清中提取富含促有絲分裂的成分,其中里面就含有大量的生長因子活性成分,作用于多種成纖細(xì)胞和上皮細(xì)胞。其研究發(fā)現(xiàn)乳中促有絲分裂物能促進(jìn)中胚層細(xì)胞增殖,但是能抑制上皮細(xì)胞生長。但是本研究卻發(fā)現(xiàn)牛初乳生長因子粗體物能促進(jìn)上皮細(xì)胞CaCO-2生長。在24h時(shí),其促細(xì)胞增殖率和含10%胎牛血清培養(yǎng)基促細(xì)胞增殖率是基本上相同的。然而,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞36,48h時(shí),牛初乳生長因子粗提物仍能促進(jìn)上皮細(xì)胞CaCO-2的生長,但是其對細(xì)胞的增殖率已經(jīng)顯著低于含10%胎牛血清培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖率。可以看出牛初乳生長因子粗提物能夠在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)上皮細(xì)胞CaCO-2生長。Timothy E. Rayner[17]等認(rèn)為盡管牛初乳促有絲分裂提取物中含有抑制上皮細(xì)胞系生長的TGF-β2,但是仍然含有很高濃度的IGF-Ⅰ,Ⅱ及其結(jié)合蛋白,EGF,PDGF,FGF-1,2,促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長。

胰島素樣生長因子-Ⅰ受體具有潛在有絲分裂原作用,正常水平下其與胰島素樣生長因子-Ⅰ結(jié)合后可致β亞單位的磷酸化激活酪氨酸激酶活性細(xì)胞信號傳導(dǎo)路徑,起到促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂增殖和轉(zhuǎn)化的作用[18]。表皮生長因子及其受體啟動的最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK,與細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化和分化相關(guān)[19]。CaCO-2細(xì)胞在含1μg/mL牛初乳生長因子粗提物時(shí)具有最大生長速率,而隨著濃度增大,增殖率反而有所降低,可能是由于作用于細(xì)胞上的生長因子受體已經(jīng)趨于飽和或者是部分作用。因?yàn)檗D(zhuǎn)化生長因子能夠抑制上皮細(xì)胞增殖,多種其他生長因子促進(jìn)細(xì)胞增殖,使得各種生長因子相互協(xié)調(diào),達(dá)到相對平衡所致。

李彩虹[20]等研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子能夠促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移,并證明了遷移與EGFR-PI3K信號通路有關(guān)。Timothy E. Rayner[10]等證實(shí)促有絲分裂乳清生長因子能加速大鼠傷口愈合速度。這與本文的研究結(jié)果是相符的。細(xì)胞遷移速度與生長因子粗提物濃度具有劑量依懶性,且作用時(shí)間越長,遷移效果越明顯。

雖然與單一生長因子的納克級相比,乳源生長因子粗提物作用范圍在微克級,但是乳源生長因子作為一種治愈腸道黏膜損傷以及替代血清應(yīng)用細(xì)胞工程具有極大的潛力。

3 結(jié)論

牛初乳中含有大量生長因子,作為一種來源廣泛,安全的原料,提取里面的生長因子治療腸胃炎癥疾病具有很大前景。本研究通過將提取的牛初乳生長因子粗提物作用于上皮細(xì)胞CaCO-2。發(fā)現(xiàn)牛初乳生長因子粗提取能顯著促進(jìn)CaCO-2細(xì)胞的增殖和增加細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量,能夠短期替代胎牛血清,而且能顯著加快細(xì)胞遷移速度,對于治療胃腸粘膜疾病具有積極作用。

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Effect of colostrum growth factors extracts on proliferation and migration of CaCO-2 cells

LIU Bin,LI Yuan-yuan,WANG Xiao-ming,CAO Feng-bo,HUO Gui-cheng,YANG Li-jie*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

In this study,the effect of colostrum growth factors extracts on the proliferation and migration of CaCO-2 cells was investigated,which provided a safe and reliable way for the treatment of human gastrointestinal inflammation. Proliferation rate of CaCO-2 cells were determined by MTT assay at 12,24,36h respectively,CaCO-2 total protein content were determinated by BCA reagent. The migration of CaCO-2 cells were determined by scratch assay after given a dose of colostrum growth factors extracts. Results indicated that CaCO-2 cells were related with colostrum growth factors extracts in a way of dose-dependent manner,compared with the control group. Colostrum growth factors with 100ng/mL could stimulated dramatically the proliferation of CaCO-2 cells at culturing 12h,by 16.3%(p<0.05). When the concentration was 1μg/mL,the cells had the maximum proliferation rate by 20.6%. Colostrum growth factors extracts with 1μg/mL could stimulate cells with maximum proliferation at culturing 24,36h,increased by 30.8% and 40.0%,respectively,but significantly lower than the proliferation rate by the medium containing 10% fetal bovine serum. Cells protein content and migration speed also had related with colostrum growth factors extracts in a way of dose-dependent manner. There were the maximum protein content and migration speed with 10μg/mL. These results demonstrated that colostrum growth factors extracts significantly accelerated cells proliferation rate,increased cell protein content and migration speed.

colostrum;growth factors;proliferation;migration

2014-06-25

劉賓(1989-),男,碩士,研究方向：乳品科學(xué)。

*通訊作者:楊麗杰(1956-),女,碩士，教授,研究方向：乳品安全與監(jiān)控。

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目基金資助。

TS252.1

A

1002-0306(2015)07-0354-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.066