汪永祿，李鳳娟，陶 勇，王 利，王 艷，王多春

不同來源金黃色葡萄球菌溶血素基因分布研究

汪永祿1，李鳳娟2，陶 勇1，王 利1，王 艷1，王多春3

目的 了解金黃色葡萄球菌溶血素的攜帶情況，為金黃色葡萄球菌的防治及溯源提供依據(jù)。方法 采用PCR擴(kuò)增分別檢測食品、臨床患者和游泳池水等不同樣本中hla、hlb、hlg和hld四種溶血素基因的分布情況，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果 317株金黃色葡萄球菌中,hla、hlb、hlg、hld四種溶血素基因的檢出情況分別為85.5%、76.3%、89.6%、89.0%；在2008-2012年之間，四種溶血素基因的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。317株金黃色葡萄球菌中共有11種溶血素基因分布模式， 檢出率最高的模式為hlb/hlg，占71.9%, 其次為hla/hld(70.3%), 最少的是hla/hlb/hlg/hld(36.3%), 不含溶血素基因的占2.2%。多數(shù)模式在3種來源菌株中的分布模式均有所不同。2008-2012年，每年同時(shí)檢出hla、hlb、hlg、hld的菌株陽性率分別為45.7%、29.4%、32.5%、33.3%和32.1%。結(jié)論 不同來源金黃色葡萄球菌中，溶血素基因攜帶及同時(shí)含有兩種或者以上的情況普遍存在。

金黃色葡萄球菌；溶血素基因；分布

金黃色葡萄球菌作為引起細(xì)菌性食物中毒的一種重要病原菌，能夠產(chǎn)生溶血毒素、殺白細(xì)胞素、腸毒素等多種毒力致病因子，且毒力強(qiáng)，具有在自然環(huán)境中廣泛分布、抵抗力強(qiáng)等特征，食品受到該菌污染的機(jī)會很多。金黃色葡萄球菌不僅是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌，同時(shí)也是醫(yī)院臨床感染的常見病原體之一，可導(dǎo)致人類皮膚、黏膜、深部組織感染以及心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒癥、中毒休克綜合癥等多種疾病。溶血素是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子，可通過作用于紅血球、血小板及溶解中性球，使其中的溶菌酵素釋出，破壞附近組織[1]。為了解不同來源標(biāo)本金黃色葡萄球菌溶血素基因的分布情況，我們對馬鞍山地區(qū)的來自于臨床患者、食品和游泳池水樣本中的金黃色葡萄球菌溶血素基因進(jìn)行了檢測?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本實(shí)驗(yàn)菌株共317株，其中食品樣本性菌株186株，分別為2008年29株、2009年30株、2010年40株、2011年57株、2012年30株；來自臨床標(biāo)本菌株83株，分別為2008年55株、2011年20株、2012年8株；來源于游泳池水樣菌株48株，分別為2008年10株、2009年4株、2011年19株、2012年15株。所有分離的菌株均確定為革蘭氏陽性菌、過氧化氫酶和血漿凝固酶陽性后，經(jīng)細(xì)菌自動儀鑒定為金黃色葡萄球菌；同時(shí)對每株菌株耐熱核酸酶基因進(jìn)行PCR檢測以進(jìn)一步確定。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.1.2 試劑與儀器 金黃色葡萄球菌染色體提取試劑盒(DNeasy blood and tissue kit)為QIAGEN公司產(chǎn)品；dNTP、2 000 bp、PCRMarker Taq酶及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自大連寶生物生物有限公司；PCR儀(MycyderTMthermal cycler)為美國伯樂公司產(chǎn)品；革蘭陽性菌鑒定卡(VITEK GPI)和VITEK-32細(xì)菌自動儀為法國梅里埃公司產(chǎn)品。其它培養(yǎng)基試劑為北京陸橋技術(shù)有限公司供應(yīng)。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)在NCBI上查的的序列，利用DNAMAN和Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)hla、hlb、hlg、hld的引物序列，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，見表1； PCR引物合成及PCR產(chǎn)物純化、測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物有限公司完成。

表1 引物信息

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的DNA的提取 取金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物增菌液100 μL，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μL Tris洗滌，加入30 μL溶金葡菌素，混勻后37 ℃孵育10 min，然后加入0.1%SDS 30 μL，混勻后37 ℃孵育30 min，即制成PCR擴(kuò)增模板。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL，其中預(yù)混反應(yīng)液12 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10 μmoL/L)1 μL，下游引物(10 μmoL/L)1 μL，滅菌雙蒸餾水9 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃40 s，49 ℃40 s(hla,hld)，54 ℃40 s(hlb,hlg), 72 ℃1 min(30個(gè)循環(huán))；72 ℃10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖濃度為1%，所用的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2.4 凝膠成像 電泳完成后的凝膠在凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察PCR擴(kuò)增條帶結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 溶血素基因檢測結(jié)果 根據(jù)PCR檢測結(jié)果，317株金黃色葡萄球菌中溶血素基因總檢出率為97.5%，hla、hlb、hlg、hld4種溶血素基因的檢出情況分別為85.5%、76.3%、89.6%、89.0%；3類不同來源標(biāo)本的金黃色葡萄球菌中，hla、hlb、hlg、hld四種溶血素基因的檢出情況，hla基因在臨床樣本中的檢出率高于食品樣本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余3種基因在3類不同來源標(biāo)本中的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

2.2 不同年份菌株溶血素基因檢出情況 本研究對金黃色葡萄球菌4種溶血素基因攜帶情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，4種溶血素基因的檢出率在分離年代上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 不同來源樣品中4種溶血素基因檢出情況

注：*，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P<0.05.

Note:*P<0.05, the difference was statistically significant.

表3 不同年代間4種溶血素基因檢出情況

2.3 4種溶血素基因在不同來源菌株中的分布模式 4種溶血素基因在317株金黃色葡萄球菌中共有11種分布模式，見表4。檢出率最高的溶血素基因模式為hlb/hlg，占71.9%, 其次為hla/hld(70.3%), 最少的是hla/hlb/hlg/hld(36.3%), 不含溶血素基因的占2.2%。在溶血素基因模式中，hla/hlb/hlg/hld、hla/hlb/hlg和不含溶血素3種模式的分布，在不同來源樣本之間無差別(P>0.05)，其余類型在3種來源樣本中的分布模式均有所不同，且經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，hla/hlg/hld、hla/hlg/hld、hla/hlg/hld在游泳池水樣本中的分離率高于食品，hla/hlb、hla/hlg在臨床樣本和游泳池水樣本中的分離率都高于食品樣本，hla/hld、hlb/hlg、hlb/hld在臨床樣本中的分離率高于食品樣本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同來源菌株中四種溶血素基因的分布模式

2.4 四種溶血素基因在不同年份菌株中的分布模式 2008年至2012年5年中，每年同時(shí)檢出hla、hlb、hlg、hld4種溶血素基因的菌株的分布情況分別為45.7%、29.4%、32.5%、33.3%和32.1%；每年同時(shí)檢出hla、hlb、hlg3種溶血素基因的菌株的分布情況分別為46.8%、47.1%、45.0%、46.9%和45.3%；同時(shí)檢出hla、hlb、hld的菌株的分布情況分別為48.9%、50.0%、52.5%、49.0%和49.1%；同時(shí)檢出hla、hlg、hld的菌株的分布情況分別為51.1%、55.9%、55.0%、53.1%和54.7%；同時(shí)檢出hlb、hlg、hld的菌株的分布情況分別為51.1%、50.0%、50.0%、51.0%和52.8%。4種溶血素基因在不同年份菌株中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同年代間四種溶血素基因的分布模式

3 討 論

金黃色葡萄球菌作為一種常見的致病菌，污染率高、耐藥譜廣、耐藥性強(qiáng)，無論發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，由其引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中占有較大的比例[2]。金黃色葡萄球菌主要是通過其產(chǎn)生的溶血素、凝固酶、殺白細(xì)胞素、腸毒素等多種致病因子，引起人和動物的多種疾病[3]。溶血素作為金黃色葡萄球菌的一種重要的致病因子，對人和哺乳動物有細(xì)胞毒作用，目前有關(guān)它的報(bào)道還比較少[4]。根據(jù)其抗原不同，金黃色葡萄球菌有α、β、γ、ε四種溶血素。目前，溶血素對組織造成損害的主要是α-溶血素和β-溶血素[5]。

本次對食品、臨床患者和游泳池水金黃色葡萄球菌溶血素的檢測結(jié)果表明， 97.5%的分離株含有一種或者以上溶血素基因，其中hla、hlb、hlg、hld的檢出率分別為85.5%、76.3%、89.6%、89.0%。 魏志恒[4]等的研究中，金黃色葡萄球菌溶血素基因總檢出率97.07%，其中α-溶血素基因總檢出率95.21%，β-溶血素基因的總檢出率為73.93%；衛(wèi)沛楠[5]等人曾對石家莊地區(qū)食品中分離的131株金黃色葡萄球菌的hla、hlb兩種溶血素基因的檢測，陽性率分別為88.51%、60.81%。這些結(jié)果與本研究一致，提示許多地區(qū)金黃色葡萄球菌中溶血素基因攜帶率較高，對人體健康是一種潛在性危險(xiǎn)，且hla的檢出率高于hlb。Elizabete Rodrigues da Silva等[6]的研究結(jié)果顯示，從患乳腺炎的山羊奶中篩選的金葡菌有76.7%分泌α-溶血素，74.4%分泌β-溶血素。與本研究的結(jié)果一致，且無論是人源還是動物源中，金黃色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素的攜帶率均較高，同時(shí)也提示，溶血素基因的分布攜帶率無地域性差異影響，菌株攜帶的溶血素基因型不會被其生存的環(huán)境所選擇。另外，文獻(xiàn)報(bào)道臨床來源的菌株，在進(jìn)化過程中獲得一些基因組島，如vSa4、噬菌體ФSal和ФSa3等[7]，這些基因組島的插入，可能會影響對溶血素基因的檢測。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，臨床來源菌株的hlb，PCR陽性率較高(85.5%)，提示hlb基因的檢測沒有受到基因組島插入的影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)，除hla外，金黃色葡萄球菌的其它溶血素基因在臨床、食品、游泳池水樣本中的分布沒有差異，說明金黃色葡萄球菌溶血素在食品樣本中的攜帶率已與臨床幾乎相同。提示食品中金葡菌的污染可能主要由二次污染所致，食品加工及監(jiān)測部門應(yīng)該加強(qiáng)對食品衛(wèi)生環(huán)境的管理[4]。同時(shí)，許多菌株普遍攜帶著兩種及兩種以上的溶血素基因，部分菌株甚至攜帶了4種，且攜帶率較高，說明溶血素普遍存在于金黃色葡萄球菌中，且不同溶血素之間可能存在著協(xié)同作用[8-9]。本研究中，無論是4種溶血素還是單獨(dú)一種，攜帶率在年代分布上的差異都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但攜帶率都較高，提示金黃色葡萄球菌的毒力作用是由多基因共同作用的，所以應(yīng)加強(qiáng)對金葡菌毒力基因的檢測。

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Wang Duo-chun, Email: wangduochun@icdc.cn

Distribution ofStaphylococcusaureushemolysin genes among different sources

WANG Yong-lu1,LI Feng-juan2,TAO Yong1,WANG Li1,WANG Yan1,WANG Duo-chun3

(1.Ma’anshanCenterforDiseaseControlandPrevention,Ma’anshan243000,China; 2.CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016,China; 3.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChinaCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the distribution ofStaphylococcusaureushemolysin, providing the basis for prevention and control and traceability ofStaphylococcusaureus. PCR was using to detect hemolysin genes ofhla,hlb,hlgandhldin the samples of food, clinical and swimming pool. The PCR products were detected by electrophoresis. Among 317 strains, the detection rate of four hemolysin genes were 85.5%, 76.3%, 89.6% and 89%; no statistical differences distribution of the four hemolysin genes by year between 2008 and 2012. There were eleven kinds of haemolysin gene patterns among 317 strains, the highest pattern washlb/hlg, accounting for 71.9%, followed byhla/hld(70.3%), the least washla/hlb/hlg/hld(36.3%), the strains of no hemolysin gene accounted for 2.2%. The distribution of most patterns was different among different sources. From year of 2008 to 2012, the positive rate ofhla,hlb,hlgandhldcarried strains detected in each year were 45.7%, 29.4%, 32.5%, 33.3% and 32.1%. The four hemolysin genes were widespread among different sources of ofS.aureus.

Staphylococcusaureus; hemolysin gene; distribution

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.010

王多春，Email:wangduochun@icdc.cn

1．安徽馬鞍山市疾病預(yù)防控制中心，馬鞍山 243000； 2．河南省疾病預(yù)防控制中心，鄭州 453600； 3. 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京 102206

R378.1

A

1002-2694(2015)09-0831-04

2015-01-20；

2015-06-02