李秀娟，崔玲玲，趙 冬，潘 琢，高偉利

基于全自動(dòng)毛細(xì)管電泳技術(shù)建立的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MLVA分型方法

李秀娟1，崔玲玲2，趙 冬1，潘 琢1，高偉利1

目的 建立針對食品來源的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)分離株的多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分型(Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis ，MLVA)方法，為暴發(fā)確認(rèn)和溯源檢測提供實(shí)驗(yàn)室支持。方法 對2005—2014年間分離自食品的91株Lm進(jìn)行14個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)位點(diǎn)的檢測，評估最優(yōu)檢測位點(diǎn)組合并分析檢測結(jié)果。結(jié)果 通過采用軟件分析，由LMV1、LMV2、LMV7、Lm10、Lm11、Lm23、LM-TR6、TR3和Lm15 等9個(gè)VNTR位點(diǎn)組成的位點(diǎn)組合為最優(yōu)MLVA檢測位點(diǎn)，可以將91株Lm分離株分為70個(gè)型別，分型能力達(dá)到0.987 1。結(jié)論 本研究建立的基于全自動(dòng)毛細(xì)管電泳的由9個(gè)檢測位點(diǎn)組成的Lm的MLVA分型方法，具有操作簡便、快速、結(jié)果客觀、操作標(biāo)準(zhǔn)化、易于在不同實(shí)驗(yàn)室間比較的優(yōu)勢，可作為一線檢測方法用于李斯特菌病的暴發(fā)確認(rèn)和溯源檢測。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分型；毛細(xì)管電泳

李斯特菌屬為革蘭染色陽性兼性厭氧無莢膜桿菌，有7個(gè)菌種，分別為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes，Lm)、綿羊李斯特菌(Listeriaiuanuii)、英諾克李斯特菌(Listeriainnocua)、威爾斯李斯特菌(Listeriainnocua)、西爾李斯特菌(Listeriaseeligeri)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)和默氏李斯特菌(Listeriamurrayi)[1-2]。Lm是唯一能引起人類疾病的李斯特菌，作為一種人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多[3]。盡管李斯特菌病的發(fā)病率相對較低，但對老年人和有免疫缺陷的感染者，致死率可達(dá)30%[4]。李斯特菌病主要通過食源性途徑感染，可引起散發(fā)和暴發(fā)事件的發(fā)生。由于該病的發(fā)病率較低，潛伏期長，最長可達(dá)71 d，導(dǎo)致在確認(rèn)李斯特菌病暴發(fā)以及追查污染源方面有較大的困難。而建立可靠的Lm分型方法，擁有分型數(shù)據(jù)庫對于暴發(fā)確認(rèn)和溯源檢測具有十分重要的意義。本研究旨在通過對分離自食品的Lm的14個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)位點(diǎn)的檢測，通過評估檢測位點(diǎn)組合，建立針對食品中Lm分離株的MLVA分型方法，確定優(yōu)勢型別，建立MLVA分型數(shù)據(jù)庫，為以后的溯源檢測和暴發(fā)確認(rèn)提供實(shí)驗(yàn)室資料支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 91株Lm為2005—2014 年分離自生禽肉、生畜肉、水食產(chǎn)品、速凍米面制品及涼拌色拉，均經(jīng)李斯特菌API Listeria生化鑒定試劑條檢測確認(rèn)。其中43株Lm分離株由石家莊市疾病預(yù)防控制中心分離，48株由河北省疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。

1.1.2 主要設(shè)備與試劑 9700型PCR儀(ABI公司)，Qiaxcel型全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀(Qiagen 公司)，GoTaq?Colorless Master Mix(Promega公司)，高分辨率的毛細(xì)管電泳卡夾(DNA High Resolution Kit Gel Cartridge，Qiagen公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備 從血平板上挑取過夜培養(yǎng)的Lm新鮮菌落至400 μL×TE(pH8.0)緩沖液中，震蕩混勻，煮沸5 min，冰上冷卻，10 000 r/min離心5 min，取上清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MLVA檢測 本研究所用MLVA檢測位點(diǎn)及引物參考文獻(xiàn)[5-9]。為了避免檢測位點(diǎn)的重復(fù)，全部22個(gè)位點(diǎn)均經(jīng)過比對確認(rèn)，最后確認(rèn)14個(gè)位點(diǎn)作為篩選位點(diǎn)，見表1。所有14個(gè)位點(diǎn)均采用單重PCR檢測，PCR體系：2 ×Gotaq?Colorless Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加水補(bǔ)足體積至25 μL。PCR參數(shù)：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用高分辨率的毛細(xì)管電泳卡夾經(jīng)全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目的確認(rèn) 對每個(gè)位點(diǎn)的不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物均送上海生工公司進(jìn)行雙向測序，參考串聯(lián)重復(fù)序列分析軟件Tandem Repeat Finder，確定重復(fù)序列數(shù)目。對于無擴(kuò)增產(chǎn)物的位點(diǎn)，重復(fù)序列數(shù)目確定為0；有擴(kuò)增產(chǎn)物而無重復(fù)序列的位點(diǎn)，相應(yīng)重復(fù)序列數(shù)目為1；其余所有菌株重復(fù)序列數(shù)目均為實(shí)際重復(fù)序列數(shù)目+1。

1.2.4 分子血清型檢測 參考文獻(xiàn)[10]，采用一個(gè)多重PCR進(jìn)行Lm的分子血清學(xué)檢測。每次PCR均使用陽性對照，陽性對照菌株為09M692(1/2c)和11M5102(4b)，由澳大利亞昆士蘭州法醫(yī)與科學(xué)研究所饋贈(zèng)。

1.2.5 譜系檢測 參考文獻(xiàn)[11]，基于毒力基因actA序列第259位至437位氨基酸的測定，采用Mega5.0軟件將各序列與文獻(xiàn)中公布的譜系特異性氨基酸序列進(jìn)行比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用辛普森指數(shù)(Simposon’s index of diversity，DI)作為計(jì)算分辨力的方法[12]，檢測位點(diǎn)的最優(yōu)組合計(jì)算采用Optimal Combination Finder (OCT)軟件進(jìn)行[13]。采用BioNumerics Version 6.6軟件對MLVA分型結(jié)果以UPGMA方法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 14個(gè)VNTR位點(diǎn)檢測結(jié)果 通過對14個(gè)VNTR位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，絕大多數(shù)位點(diǎn)均可擴(kuò)增出唯一的目的條帶，但也有些位點(diǎn)無擴(kuò)增產(chǎn)物(表1)。在91 株Lm中，LM-TR6位點(diǎn)有70株菌無擴(kuò)增產(chǎn)物，其次為Lm11、LMV9、LMV7和Lm23位點(diǎn)，菌株數(shù)分別為17、14、1和1株。Lm11位點(diǎn)無擴(kuò)增產(chǎn)物的17株菌株均為1/2a血清型，LMV9位點(diǎn)無擴(kuò)增產(chǎn)物的14株菌株均為1/2b血清型，LMV7和Lm23位點(diǎn)無擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株分別為1 株1/2a血清型和1 株1/2b血清型；而LM-TR6位點(diǎn)在28株1/2b血清型菌株中均無擴(kuò)增產(chǎn)物，在15株4b型菌株中有14株無擴(kuò)增產(chǎn)物，在1/2a型和1/2c型中，分別有27株和1株菌株無擴(kuò)增條帶。其余9個(gè)位點(diǎn)均有不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物。在14個(gè)檢測位點(diǎn)中LMV2位點(diǎn)的分型能力最強(qiáng)，將91株菌分為15個(gè)型別，分型指數(shù)為0.891 5，其次為Lm23，分型指數(shù)為0.879 1。而LM-TR2位點(diǎn)的分型能力最弱，91株菌為同一型別。

2.2 MLVA位點(diǎn)最優(yōu)組合的選擇 通過采用OCT軟件計(jì)算由2-10個(gè)檢測位點(diǎn)組成的所有組合的分型能力(表2)，發(fā)現(xiàn)隨著組合位點(diǎn)數(shù)目的增多，大體呈現(xiàn)分型能力提高的趨勢，但在組合位點(diǎn)達(dá)到9個(gè)和10個(gè)時(shí)，分型能力并無增加，而是停留在0.987 1。由此可見，由LMV1、LMV2、LMV7、Lm10、Lm11、Lm23、LM-TR6、TR3和Lm15等9 個(gè)位點(diǎn)組成的MLVA檢測體系是最優(yōu)的檢測位點(diǎn)組合，將91株菌分為70個(gè)型別，分型能力達(dá)到0.987 1。

表1 14個(gè)VNTR位點(diǎn)檢測結(jié)果

2.3 最優(yōu)的9個(gè)VNTR位點(diǎn)組合對不同血清型菌株的分型檢測 利用分子血清分型方法，可將91株Lm分為四種血清類型，分別為1/2a型(1/2a和3a)41株、1/2b型(1/2b、3b和7)28株、1/2c型(1/2c和3c)7株 和4b型(4b、4d和4e)15株。新建立的最優(yōu)的9個(gè)位點(diǎn)組合對不同血清型Lm菌株的分型能力均較好，DI值除1/2a型為0.948 7以外，余均大于0.95(表3)。各血清型的主要基因型別非常集中，且該主要基因型同時(shí)是該血清型的獨(dú)特基因型，在其他血清型中均未檢出。

2.4 進(jìn)化樹分析 采用BioNumerics Version 6.6軟件以UPGMA方法構(gòu)建進(jìn)化樹(圖1)，進(jìn)化樹分析可將91株Lm分為兩大分支，分別為譜系Ⅰ和譜系Ⅱ，譜系Ⅰ由1/2b和4b血清型的菌株組成，譜系Ⅱ由1/2a和1/2c血清型的菌株組成。譜系Ⅰ的1/2b和4b血清型混雜在一起，不能進(jìn)一步區(qū)分。而譜系Ⅱ中的7株1/2c血清型菌株單獨(dú)聚集成一支。

3 討 論

圖1 以UPGMA方法對MLVA檢測結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹

Fig.1 UPGMA dendrogram of MLVA results for 91L.monocytogenesisolates

表2 不同位點(diǎn)組合的分型能力

表3 新建立MLVA方法對不同血清型菌株的分型結(jié)果

細(xì)菌分型檢測的主要意義在于暴發(fā)確認(rèn)和污染源追蹤，根本目的是為了確認(rèn)關(guān)聯(lián)菌株。PFGE分型方法采用單一酶切，并不能很好的分辨不同的Lm菌株，需同時(shí)進(jìn)行兩種酶切才能增加分辨力。PFGE雖目前已作為金標(biāo)準(zhǔn)用于分型和暴發(fā)溯源檢測，但該方法的缺點(diǎn)如儀器昂貴、方法難于標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果分析不可避免的主觀化、結(jié)果分析需采用專門軟件等，已明顯限制了該方法的推廣應(yīng)用。目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，MLVA分型方法可區(qū)分流行病學(xué)相關(guān)菌株和非相關(guān)菌株[7,14-16]以及相關(guān)克隆和非相關(guān)克隆[17]。2007年，Murphy[8]等首次報(bào)道了采用MLVA方法進(jìn)行Lm的分型檢測，至目前也已有多篇文獻(xiàn)對該方法的建立進(jìn)行了報(bào)道。但由于各文獻(xiàn)采用不用的檢測位點(diǎn)和組合，且沒有穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)對位點(diǎn)組合進(jìn)行評估，因此到目前為止還沒有一套穩(wěn)定的位點(diǎn)組合作為Lm的MLVA分型檢測標(biāo)準(zhǔn)。在目前報(bào)道的一些檢測位點(diǎn)中，有些位點(diǎn)的分型能力較弱，有些檢測位點(diǎn)則互相重疊，另還有一些位點(diǎn)出現(xiàn)較多的無擴(kuò)增現(xiàn)象。篩選合適的檢測位點(diǎn)組合，建立標(biāo)準(zhǔn)化的位點(diǎn)組合和分型策略，對分型檢測結(jié)果的確定和比對具有十分重要的意義。

Chenal-Francisque等[17]曾根據(jù)VNTR位點(diǎn)在染色體中位置的不同，選用了18個(gè)VNTR位點(diǎn)作為檢測對象，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果是否滿意，即是否有非特異性擴(kuò)增，是否有無擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株出現(xiàn)，串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目是否容易計(jì)算等原因，選擇了11個(gè)VNTR位點(diǎn)作為優(yōu)化位點(diǎn)組合，但由于未考慮位點(diǎn)組合不同會(huì)導(dǎo)致不同分型結(jié)果，因此該方法的DI值只有0.945，低于PFGE方法。筆者曾在澳大利亞采用該14個(gè)位點(diǎn)對澳大利亞的183株Lm菌株進(jìn)行MLVA檢測，DI值最高可達(dá)0.991 4，最優(yōu)組合同樣也是9個(gè)位點(diǎn)的組合。其中與本研究相同的位點(diǎn)有LMV1、LMV2、LMV7、Lm10 Lm11、Lm23、LM-TR6，不同的位點(diǎn)是以TR3、Lm15替換了LMV6和Lm32。提示菌株來源的不同可能會(huì)導(dǎo)致不同的檢測結(jié)果，即需要不同的位點(diǎn)組合進(jìn)行MLVA分型的檢測。Lindstedt[6]也曾報(bào)道采用相同的位點(diǎn)組合針對挪威和瑞典兩個(gè)國家的Lm分型時(shí)顯示出不同的分辨能力，作者認(rèn)為分辨能力的不同是由于選取菌株來源不同所致。由于MLVA檢測方法的建立是基于具有較高變異率的VNTR位點(diǎn)，因此可能會(huì)表現(xiàn)出由于菌株來源不同，而導(dǎo)致分型能力的差異，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)不同的位點(diǎn)組合導(dǎo)致不同的分型能力的結(jié)果，因此建立一套適合我國的、穩(wěn)定的Lm的MLVA方法在李斯特菌病的防控上具有十分重要的意義。本研究最初采用14個(gè)VNTR位點(diǎn)對91株Lm進(jìn)行了檢測，通過采用OCT軟件進(jìn)行不同位點(diǎn)組合的DI值計(jì)算，考慮了不同位點(diǎn)組合對分辨力的影響，確定了由9個(gè)檢測位點(diǎn)組成的Lm 的MLVA檢測體系。

多篇文獻(xiàn)報(bào)道[7-10,14]顯示LMV2位點(diǎn)的分型能力最強(qiáng)，這與本研究的結(jié)果相同，提示該位點(diǎn)變異較大。Sperry報(bào)道[9]LM-TR6位點(diǎn)不能擴(kuò)增1/2b、3b和4b型菌株，本研究結(jié)果同樣顯示該位點(diǎn)在1/2b血清型中不存在，而分子血清型為4b的15株菌株中，同樣有14株無擴(kuò)增產(chǎn)物，而僅有的一株有擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株有可能為4d或4e型菌株，還有待進(jìn)一步做血清凝集證實(shí)。而lm11位點(diǎn)在Sperry[9]首次使用該位點(diǎn)進(jìn)行MLVA分析時(shí)，并未顯示出所有的1/2a菌株均無擴(kuò)增條帶，本研究顯示的17株1/2a菌株均無擴(kuò)增條帶，可能為樣本量少，也可能為菌株來源差異所致。LMV9位點(diǎn)在14株1/2b菌株中無擴(kuò)增條帶，這與Lindstedt[6]文獻(xiàn)中顯示的部分1/2b菌株無擴(kuò)增條帶的結(jié)果相同，但目前由于文獻(xiàn)中菌株量較少，尚無能確定該位點(diǎn)僅在1/2b菌株中會(huì)出現(xiàn)缺失。

在17種Lm的血清型中，引起人類李斯特菌病的主要為1/2a、1/2b和4b型菌株。Lindstedt[6]報(bào)道采用針對4b型菌株的VNTR位點(diǎn)進(jìn)行的MLVA分析，檢測結(jié)果經(jīng)進(jìn)化樹分析可見4b型菌株形成不同于1/2血清型的單一簇，可以用于快速區(qū)分4b型菌株。本研究采用優(yōu)化的9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行MLVA分型檢測，對不同血清型均有很好的分辨力，但進(jìn)化樹分析并不能進(jìn)一步將4b型菌株區(qū)分開來，但能區(qū)分譜系Ⅰ和譜系Ⅱ的菌株，提示該結(jié)果同樣也可為暴發(fā)和菌株的確認(rèn)提供支持。

本研究優(yōu)化的9個(gè)位點(diǎn)，雖然有LM-TR6等可產(chǎn)生較多無擴(kuò)增條帶的位點(diǎn)，但在確定整體優(yōu)化組合時(shí)，LM-TR6位點(diǎn)的加入可使分型數(shù)目由69增加至70，增加了一個(gè)基因型，DI值達(dá)最大。本研究結(jié)果還顯示，Lm23與Lm15兩個(gè)位點(diǎn)的組合，DI值即可達(dá)到0.950 9，可滿足區(qū)分不同菌株的能力，提示當(dāng)檢測菌株數(shù)量較多，時(shí)間較緊時(shí)，可以通過減少檢測位點(diǎn)的數(shù)量，同樣可達(dá)到很好的分析結(jié)果，可作為實(shí)驗(yàn)室的一線方法用于李斯特菌病暴發(fā)調(diào)查和監(jiān)測。

本研究所用的Lm均來源于食品，雖然來源較單一，但采用本研究確定的MLVA方法仍可將91株菌分為70個(gè)基因型別，分型能力達(dá)0.987 1，可用于不同血清型Lm菌株的分型檢測。該方法建立在普通PCR基礎(chǔ)之上，聯(lián)合使用高分辨率的全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，具有操作簡便、快速、價(jià)廉、高通量、重復(fù)性好，可對食品樣品直接進(jìn)行檢測[16]的優(yōu)點(diǎn)，另外該方法將檢測結(jié)果數(shù)字化，而非采用圖片分析形式，減少了在結(jié)果分析過程中的主觀影響，更易實(shí)現(xiàn)結(jié)果客觀化和操作標(biāo)準(zhǔn)化，因此便于不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比較。據(jù)此可建立類似于PulseNet網(wǎng)絡(luò)的在線數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行全國范圍的結(jié)果比較，從而為該菌在大范圍內(nèi)的暴發(fā)事件確認(rèn)提供支持。

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Development of a multiple-locus variable number of tandem repeat typing method forListeriamonocytogenesupon the capillary electrophoresis

LI Xiu-juan1,CUI Ling-ling2,ZHAO Dong1,PAN Zhuo1,GAO Wei-li1

(1.DepartmentofMicrobiology,ShijiazhuangCenterforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050011,China; 2.HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

In order to develop a multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) method forListeriamonocytogenes(L.monocytogenes), a total of 14 variable number of tandem repeats (VNTR) loci were used to detect the 91L.monocytogenesisolated from food. Results showed that the optimal combination of loci consisted of 9 loci (LMV1, LMV2, LMV7, Lm10, Lm11, Lm23, LM-TR6, TR3, Lm15), which produced the high level of discriminatory ability with Simpson index of 0.987 1 for foodborneL.monocytogenes, could divided 91L.monocytogenesisolates into 70 subtypes. This method required only one conventional PCR followed by automated capillary electrophoresis, providing high discriminatory ability. It was simple, easy to perform, relatively fast, inexpensive, objective, standardized operating and could provide conveniently interlaboratory comparisons, which would be useful in outbreak investigations and listeriosis surveillance as a first line screening method.

Listeriamonocytogenes; multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA); capillary electrophoresis

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.012

1.石家莊市疾病預(yù)防控制中心,石家莊 050011 2.河北師范大學(xué),石家莊 050000; Email:wsws1120@126.com

R378.99

A

1002-2694(2015)09-0839-06

2015-03-12；

2015-06-12