趙金鳳，齊 萌，王海燕，化 軍，張 娜，張昆坡，李俊強(qiáng)，劉 群

開封地區(qū)奶牛隱孢子蟲種類及基因型鑒定

趙金鳳1,2，齊 萌2，王海燕3，化 軍3，張 娜2，張昆坡2，李俊強(qiáng)2，劉 群1

目的 探討開封地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況和種類分布。方法 采用飽和蔗糖溶液漂浮法檢查新鮮糞便樣本的隱孢子蟲卵囊，用18S rRNA基因?qū)﹄[孢子蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制性片段長度多態(tài)性分析；基于gp60基因位點(diǎn)對(duì)微小隱孢子蟲進(jìn)行基因亞型鑒定。結(jié)果 糞便樣本中隱孢子蟲陽性率為8.4% (52/622)，不同調(diào)查點(diǎn)、年齡段和養(yǎng)殖條件下奶牛隱孢子蟲感染率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?；?8S rRNA基因位點(diǎn)成功擴(kuò)增出50個(gè)樣本，分別經(jīng)SspI和MboII酶切進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)安氏隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種，為23份，微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲分別為5份、12份和6份，4份為牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染。序列分析顯示5個(gè)微小隱孢子蟲均為人獸共患基因亞型IIdA19G1。結(jié)論 開封地區(qū)奶牛感染人獸共患微小隱孢子蟲基因亞型，具有人獸共患傳播的可能性。

隱孢子蟲；基因型；鑒定；奶牛

ZHANG Kun-po2,LI Jun-qiang2,LIU Qun1

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的人獸共患腸道原蟲，目前有27個(gè)種和70多個(gè)基因型，多數(shù)蟲種和基因型具有宿主特異性，對(duì)自然宿主的致病性也存在較大差異[1-3]。牛是人類隱孢子蟲病的重要傳染源，常見寄生于牛的有微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)，安氏隱孢子蟲(C.andersoni)，牛隱孢子蟲(C.bovis)和芮氏隱孢子蟲(C.ryanae)，牛還可感染其它10個(gè)隱孢子蟲蟲種/基因型[1,4]。其中，微小隱孢子蟲(C.parvum)主要引起未斷奶犢牛嚴(yán)重腹瀉甚至死亡，并可導(dǎo)致包括人在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物腹瀉；安氏隱孢子蟲主要引起斷奶后牛胃粘膜損傷和萎縮；牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲尚未發(fā)現(xiàn)明顯致病性[5]。

依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，安氏隱孢子蟲與其他3種隱孢子蟲易于區(qū)分，而微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲通過顯微鏡觀察難以區(qū)分。Feng等[6]建立了基于SspI和MboII限制性內(nèi)切酶的PCR-RFLP能有效區(qū)分該4種隱孢子蟲，現(xiàn)常用于牛隱孢子蟲種類的分布研究。微小隱孢子蟲是3種重要的人獸共患隱孢子蟲之一，但并非所有微小隱孢子蟲分離株均可在人和動(dòng)物之間進(jìn)行傳播，基因亞型分析工具常用于隱孢子蟲群體遺傳結(jié)構(gòu)鑒定和人獸共患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[7-8]。目前微小隱孢子蟲基于gp60基因分為IIa-l共11個(gè)亞型家族，IIa和IId亞型家族可在人和反芻動(dòng)物之間傳播，而IIc和IIe亞型家族僅通過人-人途徑傳播，其它亞型家族多具有宿主特異性[8]。本研究對(duì)開封地區(qū)奶牛進(jìn)行隱孢子蟲感染調(diào)查，鑒定隱孢子蟲種類，并對(duì)微小隱孢子蟲(C.parvum)進(jìn)行亞型分析。

1 材料與方法

1.1 樣本 2012年11月-2014年3月對(duì)開封地區(qū)4個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和5個(gè)奶牛養(yǎng)殖小區(qū)隨機(jī)經(jīng)直腸采集622頭奶牛新鮮糞便樣本，外觀均無明顯異常，每份10～30 g，裝入潔凈自封袋中，記錄信息，帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃保存，48 h內(nèi)檢測(cè)。

1.2 檢查方法 取5 g樣本，加30 mL自來水?dāng)嚢杌靹颍?jīng)40目不銹鋼糞篩過濾至50 mL離心管內(nèi)；3 000 r/min離心3 min；棄上清，保留沉淀物；于沉淀物中加30 mL飽和蔗糖漂溶液，充分?jǐn)噭颍? 000 r/min離心5 min；用鐵絲吊環(huán)蘸取表層漂浮液置載玻片上，加蓋玻片，400倍光鏡檢查。每片觀察200個(gè)視野，發(fā)現(xiàn)卵囊者即判定為陽性。

1.3 樣本DNA提取 取鏡檢為隱孢子蟲陽性的200 mg糞便樣本，用美國 OMEGA Bio-Tek生產(chǎn)的糞便DNA提取(Stool DNA Kit)試劑盒(D4015-02)按說明書步驟操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.4 PCR和PCR-RFLP 18S rRNA和gp60引物及其反應(yīng)程序分別參照Xiao等[9]和Alves等[10]的方法，引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。反應(yīng)體系中加入模板DNA 1 μL，25 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，Mg2+1.5 μL，KOD-plus酶0.5 μL(日本TOYOBO公司生產(chǎn))，加滅菌雙蒸水至25 μL，第2次PCR的模板為第1次PCR的1 μL產(chǎn)物。取5 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL 10×Loading Buffer混合均勻，加入1%瓊脂糖凝膠加樣孔，每排第一孔加5 μL DNA Marker DL2000作對(duì)照，電泳結(jié)束后在電泳凝膠成像系統(tǒng)儀中觀察拍照。

參照Xiao等[11]和Feng等[6]的方法采用限制性內(nèi)切酶SspI、MboII對(duì)18s rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，根據(jù)酶切圖譜鑒定隱孢子蟲蟲種。

1.5 測(cè)序 PCR產(chǎn)物測(cè)序委托北京諾賽基因有限公司完成，采用雙脫氧終止法進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序儀為ABI PRISMTM3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。在GenBank上用Blast進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用Clustal X 1.83進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛隱孢子蟲感染情況 糞便樣本中隱孢子蟲陽性率為8.4%(52/622)，不同調(diào)查點(diǎn)奶牛隱孢子蟲感染率具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。5個(gè)養(yǎng)殖小區(qū)中有3個(gè)為隱孢子蟲陽性，感染率分別為4.5%(2/44)、9.4%(3/32)和1.4%(1/69)，不同養(yǎng)殖小區(qū)奶牛隱孢子蟲感染率具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均為隱孢子蟲陽性，養(yǎng)殖場(chǎng)1、2、3、4奶牛隱孢子蟲感染率分別為17.7%(14/79)、6.9%(10/145)、14.3%(12/84)和10.4%(10/96)，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<30 d、31～60 d、61～120 d、121～180 d、181～360 d和>360 d奶牛隱孢子蟲感染率分別為13.9%(5/36)、9.5%(7/74)、13.8%(15/109)、7.1%(7/98)、9.0%(13/144)和3.1%(5/161)，不同年齡段奶牛隱孢子蟲感染率具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；規(guī)模化養(yǎng)殖條件下奶牛隱孢子蟲感染率為11.4%(46/404)，顯著高于散養(yǎng)條件下2.8%(6/218)，不同養(yǎng)殖條件下奶牛隱孢子蟲感染率具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 PCR和PCR-RFLP結(jié)果 基于18S rRNA基因位點(diǎn)，52份陽性樣品中有50份成功擴(kuò)增出830bp目的片段。經(jīng)SspI和MboII酶切鑒定為安氏隱孢子蟲的有23份，微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲分別為5份、12份和6份，混合感染的有4份，均為牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染。見圖1。

M. 100 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1-5：牛隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲的SspI酶切結(jié)果； 6-10：牛隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲的MboII酶切結(jié)果

M: 100 bp DNA marker; 1-5:C.bovis,C.bovis+C.ryanae,C.ryanae,C.andersoni, andC.parvumdigested bySspI enzyme; 6-10:C.bovis,C.bovis+C.ryanae,C.ryanae,C.andersoni, andC.parvumdigested byMboII enzyme.

圖1 18S rRNA基因PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析結(jié)果

Fig.1 Results of PCR products of 18S rRNA gene digested by RFLP

2.3 不同養(yǎng)殖模式下奶牛隱孢子蟲種類分布 散養(yǎng)條件下的6個(gè)隱孢子蟲分離株成功擴(kuò)增并進(jìn)行RFLP， 2份為安氏隱孢子蟲，4份為牛隱孢子蟲。規(guī)?；曫B(yǎng)條件下的46個(gè)隱孢子蟲分離株有44份成功擴(kuò)增并進(jìn)行RFLP，安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲分別為21份、5份、8份和6份，4份牛隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲混合感染；4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中有3個(gè)發(fā)現(xiàn)有隱孢子蟲混合感染，僅在規(guī)?；?場(chǎng)發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲感染。

2.4 不同年齡段奶牛隱孢子蟲種類分布 <30 d奶牛中發(fā)現(xiàn)5份微小隱孢子蟲感染；牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲主要感染31～180 d奶牛，分別為12份和6份，其余年齡段未見感染；23份安氏隱孢子蟲發(fā)現(xiàn)于>61 d奶牛，>180 d奶牛僅發(fā)現(xiàn)有安氏隱孢子蟲感染。31～60 d、61～120 d和121～180 d 奶牛的牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染分別為2份、1份和1份。

2.5 微小隱孢子蟲基因亞型序列分析 基于gp60基因位點(diǎn)對(duì)5份微小隱孢子蟲的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得序列在GenBank用Blast進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用Clustal X 1.83 比對(duì)，結(jié)果顯示5條序列與人獸共患基因亞型IIdA19G1(HQ009809和DQ280496)序列同源性為100%，鑒定5個(gè)微小隱孢子蟲分離株為IIdA19G1亞型。

3 討 論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)開封地區(qū)5個(gè)養(yǎng)殖小區(qū)中有3個(gè)為隱孢子蟲陽性場(chǎng)，4個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中均為隱孢子蟲陽性場(chǎng)，表明該地區(qū)奶牛隱孢子蟲流行較為普遍，總感染率為8.4%，低于盧慶斌等[12]報(bào)道的河南省12月齡以內(nèi)奶牛隱孢子蟲感染率(26.12%)，高于安徽省和黑龍江省奶牛隱孢子蟲的感染率(5.18%和5.3%)[13-14]。國內(nèi)早期有關(guān)牛隱孢子蟲的調(diào)查和鑒定多采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，對(duì)蟲種鑒定區(qū)分能力有限。梁楠等[15]采用SspI和VspI酶切鑒定自牛分離的大型卵囊均為安氏隱孢子蟲，與形態(tài)學(xué)觀察鑒定相一致。林潔等[16]采用SspI和MboII酶切鑒定渝西地區(qū)奶牛有3種隱孢子蟲，安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲，以安氏隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種；Wang 等[17]采用SspI和MboII酶切鑒定出河南省規(guī)?；膛?chǎng)斷奶前犢牛感染4種隱孢子蟲，以微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種，并發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲/牛隱孢子蟲、微小隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲/微小隱孢子蟲混合感染。本研究采用SspI和MboⅡ酶切鑒定隱孢子蟲，發(fā)現(xiàn)安氏隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種，并發(fā)現(xiàn)牛隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲混合感染，與上述報(bào)告一致。

分析顯示，牛隱孢子蟲感染率隨年齡增長而下降，微小隱孢子蟲主要感染斷奶前犢牛，牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲主要感染幼齡牛和青年牛，而安氏隱孢子蟲常見于青年牛和成年牛[1,6,17-19]。Feng等[6]研究發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲存在地方性流行，其鑒定上海5個(gè)斷奶前犢牛隱孢子蟲分離株4個(gè)為牛隱孢子蟲，1個(gè)為芮氏隱孢子蟲，1個(gè)斷奶后分離株為牛隱孢子蟲；而Liu等[14]報(bào)道黑龍江省低于2月齡犢牛未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染，27個(gè)斷奶后犢牛和成年奶牛隱孢子蟲分離株，26個(gè)為安氏隱孢子蟲，一個(gè)為芮氏隱孢子蟲，進(jìn)一步證實(shí)微小隱孢子蟲存在地方性流行。本次調(diào)查不同年齡段奶牛隱孢子蟲感染率具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，隨奶牛年齡增長隱孢子蟲感染率呈下降趨勢(shì)，與Wang 等[19]調(diào)查發(fā)現(xiàn)河南省斷奶后奶牛隱孢子蟲感染情況相符；不同年齡段奶牛隱孢子蟲蟲種分布也存在顯著差異，犢牛感染以微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲為主，而青年牛和成年牛以安氏隱孢子蟲為主，與Wang 等[17,19]報(bào)道均相一致。

牛隱孢子蟲感染與多種因素相關(guān)，如品種、環(huán)境、飼喂方式、管理因素、衛(wèi)生狀況及季節(jié)，均可影響隱孢子蟲的傳播流行。發(fā)達(dá)國家牛隱孢子蟲感染和發(fā)展中國家存在差異，其幼齡牛感染蟲種也存在較大差異，研究認(rèn)為與其飼養(yǎng)規(guī)模、牛舍分布和集約化飼喂程度密切相關(guān)，日本、印度、馬來西亞、澳大利亞和加拿大等國報(bào)道的放牧牛隱孢子蟲感染率低于規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的奶牛[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)和規(guī)?；B(yǎng)殖條件下，奶牛腸道寄生蟲感染率具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，提示規(guī)?；B(yǎng)殖更易群體感染隱孢子蟲。

寄生于牛的4種隱孢子蟲中，微小隱孢子蟲是最常見的3種人獸共患蟲種之一[1]。國內(nèi)奶牛養(yǎng)殖量大，地域分布廣，隱孢子蟲病特別是分子流行病學(xué)尚研究較少，對(duì)牛源微小隱孢子蟲人獸共患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究工作也開展較少。本研究通過分子生物學(xué)鑒定5個(gè)微小隱孢子蟲分離株均與先前河南省奶牛流行的人獸共患基因亞型IIdA19G1一致，為評(píng)估隱孢子蟲風(fēng)險(xiǎn)提供了依據(jù)，進(jìn)一步表明奶牛源隱孢子蟲對(duì)人類構(gòu)成潛在威脅，同時(shí)為我國奶牛源隱孢子蟲分子流行病學(xué)研究提供了基礎(chǔ)資料。

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Species and genotype identification ofCryptosporidiumin dairy cattle in Kaifeng, China

ZHAO Jin-feng1,2,QI Meng2,WANG Hai-yan3,HUA Jun3,ZHANG Na2,

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;3.DepartmentofAnimalScience,HenanVocationalCollegeofAgriculture,Zhongmu451450,China)

To identifyCryptosporidiumspecies and subtype in dairy cattle in Kaifeng, China, fresh fecal samples were detected by using the Sheather’s sugar flotation method, and theCryptosporidium-positive samples were identified with a restriction fragment length polymorphism analysis of the small subunit ribosomal RNA.C.parvumwas subtyped by using 60 kDa glycoprotein (gp60) gene. The infection rates ofCryptosporidiumspp. was 8.4% (52/622). Significant differences were observed between the infection rate of sampling sites, age and feeding condition (P<0.01). In the 18S rRNA gene, 50 isolates were successfully amplified, and the PCR product was digested with restriction enzymesSspI andMboII, respectively. The result showed thatC.andersoniwas the dominant species (n=23), as well as other species ofCryptosporidiumwereC.parvum(n=5),C.bovis(n=12) andC.ryanae(n=6), and the occurrence of infections with mixedC.bovisandC.ryanae(n=4). Sequence analyses ofgp60 gene revealed that five isolates were zoonotic subtype IIdA19G1. Dairy cattle infected zoonoticC.parvumsubtype in Kaifeng, which is of capability of potential transmission between human and animal.

Cryptosporidium; genotype; identification; dairy cattle

Liu Qun, Email: qunliu@cau.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.010

河南省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)(No.012IRTSTHN005)和國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.31330079)

劉群, Email: qunliu@cau.edu.cn

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京 100193； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院， 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，中牟 451450

Supported by the Program for Science and Technology Innovative Research Team at the University of Henan Province (No. 012IRTSTHN005), and the State Key Program of the National Natural Science Foundation of China (No. 31330079)

R382

A

1002-2694(2015)08-0733-04

2014-10-19；

2015-02-11