熊長(zhǎng)輝,楊 夢(mèng)，劉曉青，徐曉倩，王 鵬，袁 輝

一次食物中毒相關(guān)的侵襲性大腸桿菌分子分型分析

熊長(zhǎng)輝,楊 夢(mèng)，劉曉青，徐曉倩，王 鵬，袁 輝

目的 對(duì)一起食物中毒分離的病原菌進(jìn)行鑒定、毒力基因檢測(cè)及分子分型。方法 利用生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，用普通PCR和real-time PCR對(duì)病原菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，用PFGE對(duì)其同源性進(jìn)行分析。結(jié)果 分離的12份病原菌均為EscherichiacoliI，血清型為EIEC O136K78，12份病原菌均攜帶uid、ipaH基因，其中5份檢測(cè)攜帶vir基因。PFGE電泳圖譜顯示12株病原菌帶型完全相同，表明來(lái)源于同一克隆株。結(jié)論 分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)方法的有機(jī)結(jié)合對(duì)侵襲性大腸埃希菌的快速鑒定及分子分型具有重要意義。

侵襲性大腸埃希菌；分子分型；PCR；脈沖場(chǎng)凝膠電泳

致瀉性大腸埃希菌是引起人體以腹瀉癥狀為主的全球性疾病的常見(jiàn)病原菌，是目前世界公認(rèn)人畜共患的引起食源性疾病的重要病原菌[1]。根據(jù)研究顯示，35.7%的腹瀉患兒糞便標(biāo)本中有致瀉性大腸埃希菌， 以產(chǎn)毒性大腸埃希菌、侵襲性大腸埃希菌和致病性大腸埃希菌為主，在我國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)致瀉大腸埃希菌均位于兒童腹瀉病原菌的前3位[2-4]。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 一起食物中毒分離菌株12株。

1.1.2 參考菌株 EIEC陽(yáng)性菌株號(hào) CMCC44825 中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 主要試劑及耗材 API 20E生化鑒定試劑盒(bioMerieux)、PCR引物合成(上海生工生物公司)、TaqDNA 聚合酶和dNTPs(TaKaRa)、致瀉性大腸診斷血清(寧波天潤(rùn))，致瀉性大腸 real-time PCR檢測(cè)試劑盒(深圳市生科源技術(shù)有限公司)，XbaI內(nèi)切酶(TaKaRa)，一次性Falcon 2054試管(BD公司)，一次性50 mL screw-cap tube(BD公司)， SeaKem Gold Agarose(瑞士Lonza公司)，普通瓊脂糖(GENE 公司)。

1.3 主要儀器 微量高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf)、PCR 擴(kuò)增儀(Bio-Rad)、自動(dòng)凝膠成像儀(Bio-Rad)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng) CHEF MAPPER(Bio-Rad)，real-time PCR儀(ABI 7300)，細(xì)菌濁度儀(bioMerieux)，超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈安泰SW-CJ-2FD)、 培養(yǎng)箱(日本EYELA SLI-1200)、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA 3-18K)、生物安全柜(美國(guó)Thermo)。

1.4 方法

1.4.1 生化鑒定 從三糖鐵上挑取菌苔按API 20 E使用操作說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.2 血清玻片凝集實(shí)驗(yàn) 挑取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物，用致瀉性大腸的多價(jià)O血清作玻片凝集實(shí)驗(yàn)，然后用該多價(jià)血清所包含的O單價(jià)血清作玻片凝集實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 PCR檢測(cè)方法

1.4.3.1 PCR擴(kuò)增引物(表1)

表1 引物序列

1.4.3.2 菌株模板制備 采用熱裂解法制備DNA 模板。熱裂解法: 挑取菌落于100 μL去離子水的eppendorf管中，放于金屬裂解儀中100 ℃ 15 min 后, 12 000 r/min離心5 min，取上清即為PCR 擴(kuò)增模板。

1.4.3.3 PCR 操作方法 PCR反應(yīng)總體積為25 μL，在0.2 mL eppendorf管中依次加入:10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTPS(每種dNTP溶液終濃度為0.2 mmol/L) 0.5 μL；引物F( 20 μmol/L) 、引物R(20 μmol/L)各1 μL； Taq 酶0.5 μL；去離子水17.5 μL；模板2 μL。

反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃ 5 min。變性94 ℃ 30 s，退火 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min， 30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.4.4 熒光PCR 反應(yīng)試劑和特異性引物/探針均由深圳市生科源技術(shù)有限公司提供。反應(yīng)體系總體積為25 μL，內(nèi)含0.05 mol/L MgCl2，0.2 mol/L dNTPs及特異性引物/探針(各0.5 mol/L)的Tris-EDTA緩沖液(0.01 mol/L PH8.0)，DNA 模板為5 μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min， 95 ℃ 3 min，在95 ℃ 5 s，55 ℃ 60 s條件下循環(huán)40次，55 ℃ 60 s階段結(jié)束時(shí)在FAM通道采集熒光信號(hào)。所有毒力基因的檢測(cè)均設(shè)有陰、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照。

1.4.5 PFGE 參照PulseNet China標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案。

2 結(jié) 果

2.1 生化鑒定 12株菌API 20E生化結(jié)果一致(見(jiàn)表2)，編碼為1044552，經(jīng)查驗(yàn)為EscherichiacoliI。

表2 API 20E生化結(jié)果

2.2 血清玻片凝集實(shí)驗(yàn) 經(jīng)血清玻片凝集實(shí)驗(yàn)，所有菌株均為EIEC O多價(jià)Ⅱ血清及O136K78單價(jià)血清凝集。

2.3 PCR鑒定結(jié)果 12株菌的PCR結(jié)果如表3，電泳圖譜見(jiàn)圖1～3。

2.4 熒光PCR結(jié)果 用深圳市生科源技術(shù)有限公司提供的試劑進(jìn)行檢測(cè)，其中12株菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為EIEC陽(yáng)性，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4 。

表3 PCR結(jié)果

圖1 uid 引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 vir 引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖4 real-time PCR 擴(kuò)增曲線

2.5 PFGE 經(jīng)過(guò)PFGE圖譜(圖5)基因組同源性分析發(fā)現(xiàn)，12株分離菌均來(lái)自同一個(gè)克隆。

3 討 論

食源性疾病并不隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展技術(shù)進(jìn)步而減少或消失，世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件接連發(fā)生，食源性疾病未能受到有效控制。近年來(lái)，全球食源性疾病發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)。致瀉大腸埃希菌引發(fā)的腸道感染疾病越來(lái)越多，在腸道病原菌中所占比重已超過(guò)志賀菌成為最常見(jiàn)的腹瀉病原菌[5-6]。快速檢測(cè)和鑒定病原菌, 是及時(shí)有效地指導(dǎo)臨床用藥、控制與預(yù)防傳染病傳播的重要手段，隨著科學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，利用五類(lèi)致瀉性大腸埃希菌特異基因進(jìn)行檢測(cè)和鑒別的PCR及real-time PCR方法得到廣泛應(yīng)用[7-9]。使人們逐漸重視大腸桿菌所引起的腹瀉[10]和食物中毒[11]等疾病。PCR是近十多年來(lái)應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法,在食源性致病菌的檢測(cè)中均是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。其大量研究表明,PCR在對(duì)食品中病原微生物的確證試驗(yàn)方面與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比至少具有相同的靈敏度,而多數(shù)情況下則表現(xiàn)出更高的靈敏度,陽(yáng)性檢出率更高,而且檢測(cè)周期大為縮短。從傳統(tǒng)意義上講，檢測(cè)食源性病原菌的方法主要依賴(lài)于培養(yǎng)基對(duì)存活的細(xì)胞進(jìn)行選擇分離和傳代。雖然這種方法很有效，但卻耗時(shí)耗力，完成一次檢測(cè)通常需要幾天時(shí)間。而生化試驗(yàn)只能將已分離菌鑒定至是否屬于大腸桿菌，不能區(qū)分是致病還是普通非致病大腸桿菌，血清學(xué)方法易受人為因素干擾和產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題影響，使得進(jìn)行細(xì)菌鑒定時(shí)常會(huì)誤檢和漏檢，給致瀉性大腸埃希菌的檢測(cè)和研究帶來(lái)不便。利用PCR及real-time PCR方法可以補(bǔ)充傳統(tǒng)方法的不足，它具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)的12株病原菌用普通PCR均檢出 uid、ipaH基因，其中5株還檢出vir基因。用real-time PCR檢測(cè)12株菌均可確定為含有ipaH基因的EIEC(實(shí)驗(yàn)試劑中只設(shè)計(jì)有ipaH基因引物/探針)。

圖5 PFGE電泳圖譜

PFGE分型技術(shù)是目前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)除基因測(cè)序外在重復(fù)性、特異性、分辨力、準(zhǔn)確度上最好的方法之一，其能夠在基因組水平上對(duì)細(xì)菌的變異特征進(jìn)行分析，是以病原菌分析為基礎(chǔ)的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)用于相互比較和利用的技術(shù)方法，可以從分子水平研究細(xì)菌的遺傳和變異情況, 由于不同菌株的電泳圖譜具有高度特異性，用目視即可觀察到不同大小的限制性片段形成的條帶，如采用掃描和電腦分析，則更能準(zhǔn)確、快速地識(shí)讀和比較基因組的變異情況，從而識(shí)別特異的菌株。無(wú)論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家,食源性疾病和傳染病的發(fā)生率仍居高不下,在人類(lèi)疾病中占據(jù)很大的比例。在發(fā)生食源性疾病或傳染病時(shí),及時(shí)確定病原體,并在此基礎(chǔ)上對(duì)不同來(lái)源的病原體進(jìn)行比較,是確定傳染源、從根本上控制疾病的必需條件。本次實(shí)驗(yàn)利用PFGE對(duì)所檢測(cè)的菌株進(jìn)行同源分析，結(jié)果顯示12株菌均來(lái)自于同一克隆。分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)致瀉性大腸桿菌的快速鑒定及分子分型，有效的指導(dǎo)臨床用藥，及時(shí)救治生命，預(yù)防食物中毒，保障公眾健康具有重大意義。在今后的疾病預(yù)防控制工作中，針對(duì)食物中毒，應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行比對(duì)分析，用分子流行病學(xué)對(duì)其生物學(xué)特性做進(jìn)一步研究，以便查找傳染來(lái)源、分析傳播鏈，加強(qiáng)監(jiān)控和阻斷，以達(dá)到預(yù)防和控制疾病的目的。

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Yuan Hui, Email: jxcdcyuanhui@126.com

Genotype identification and laboratory examination of EIEC from a case of food contamination

XIONG Chang-hui,YANG Meng,LIU Xiao-qing,XU Xiao-qian,WANG Peng,YUAN Hui

(JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

We conducted the identification, virulence gene detection and the characteristics of molecular typing of the pathogen in a food poisoning outbreak. The pathogens were confirmed by bacteria isolation, identification, biochemical tests and serologic tests, and then PCR and real-time PCR methods were used to detect virulence factors and molecular typing of pathogens. After the genome of the pathogens was digested by restricted enzymeXbaI, the electrophoresis fingerprint was obtained by PFGE, and homology analysis was performed. Results showed that the separation of 12 pathogenic bacteria wereEscherichiacoliI and serotype O136K78, which carrying the uid and ipaH genes and five strains including vir gene. The strains of EIEC were isolated from the patients, which had the same PFGE pattern. It is very great significance of the combination of molecular biology technology and the traditional method of identification and molecular classification in EIEC, the studies showed its important value in clinical diagnosis and epidemiological investigation.

EIEC; molecular classification; PCR; PFGE

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.013

袁輝，Email:jxcdcyuanhui@126.com

江西省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，南昌 330029

R378

A

1002-2694(2015)08-0747-04

2015-01-07；

2015-03-19