蔣潔蓉, 楊 瑤, 王田田, 黃 璐, 黃啟英

(1.江蘇省紡織產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院， 南京 210007; 2.南京師范大學(xué) 金陵女子學(xué)院， 南京 210027)

紡織品抗菌性能測試中試驗菌活性確定的研究

蔣潔蓉1, 楊 瑤2, 王田田1, 黃 璐2, 黃啟英1

(1.江蘇省紡織產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院， 南京 210007; 2.南京師范大學(xué) 金陵女子學(xué)院， 南京 210027)

研究了對定時擴(kuò)增培養(yǎng)后菌液OD600值與紡織品抗菌性能測試中試驗菌活性確定相關(guān)性，有效地縮減了織物抗菌性能振蕩測試法中試驗有效性判定所需的試驗周期。研究中確定了以擴(kuò)增培養(yǎng)3.5 h后的試驗菌OD600值作為紡織品抗菌性能測試中試驗菌活性的評判指標(biāo)；結(jié)果顯示OD600值大于0.6的菌液制備接種菌液，標(biāo)準(zhǔn)空白試驗菌增長值F≥1.0，即后續(xù)抗菌性能測試試驗有效；當(dāng)OD600值在0.6～0.8時，OD600值越大，F(xiàn)值越大，即后續(xù)抗菌性能測試試驗結(jié)果越準(zhǔn)確。

紡織品; 抗菌性能; OD600值; 菌種活性; 試驗有效性

抗菌紡織品能抑制微生物生長，使織物具有抗菌防臭效果。近年來，抗菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，各種抗菌產(chǎn)品也紛紛面市[1]。但在中國，紡織品抗菌檢測項目較其他傳統(tǒng)的紡織品檢測項目而言，開展的時間短，檢測的機(jī)構(gòu)少，且各單位對各項標(biāo)準(zhǔn)的理解存在分歧。同時，由于微生物的培養(yǎng)[2]、實(shí)驗人員的操作、標(biāo)準(zhǔn)判定的基準(zhǔn)[3-4]也存在異動因素。因此，目前國內(nèi)檢測機(jī)構(gòu)間及各檢測機(jī)構(gòu)內(nèi)不同實(shí)驗人員間檢測結(jié)果不一致，在一定程度上制約了抗菌紡織品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在各抗菌紡織品的性能檢測方法中廣為采用的是振蕩法，該方法是動態(tài)測試法，測試原理是抗菌試樣與菌液振蕩反應(yīng)，檢測樣品與菌液接觸前后的抗菌性。該檢測方法對試樣的形狀和吸水性要求都不高，且對于粉末狀、液體狀、羽絨羽毛及不規(guī)則形狀織物等都能使用。因此，本文選取振蕩法進(jìn)行研究，通過確立試驗菌株的培養(yǎng)條件這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步建立振蕩法檢測抗菌紡織品的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗流程奠定基礎(chǔ)。

1 試 驗

1.1 材料與儀器

材料：革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌ATCC 6538、革蘭氏陰性菌為大腸桿菌ATCC 25922(江蘇省博達(dá)生物衛(wèi)生技術(shù)有限公司)，營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，純平紋棉標(biāo)準(zhǔn)貼襯織物(平方米質(zhì)量為(105±5)g/m2，上海市紡織工業(yè)技術(shù)監(jiān)督所)。

儀器：YJ-875凈化工作臺(蘇州工業(yè)園區(qū)三興凈化科技有限公司)、SX-500高壓滅菌鍋(日本TOMY公司)、FED400烘箱(德國賓德公司)、LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、THZ-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉實(shí)驗設(shè)備廠)、6132核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)、Galaxy230菌落計數(shù)器(臺灣ROCKER)。

1.2 方 法

1.2.1 試劑配制

按照FZ/T 73023—2006《抗菌針織品》中相關(guān)條款配制下列試劑。

營養(yǎng)肉湯的配制：牛肉浸膏，3 g；蛋白胨，5 g；氯化鉀，5 g；去離子水(最終定容)1000 mL。滅菌后pH值為6.8±0.2。

營養(yǎng)瓊脂培的配制：牛肉浸膏，3 g；蛋白胨，5 g；氯化鉀，5 g；瓊脂粉，15 g；去離子水(最終定容)1 000 mL。滅菌后pH值為6.8±0.2。

0.03 mol/L PBS(磷酸鹽)緩沖液的配制：磷酸氫二鈉，2.84 g；磷酸二氫鉀，1.26 g；去離子水(最終定容)1 000 mL。滅菌后pH值為7.2～7.4，溫度4～10 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)空白樣的制備

準(zhǔn)備符合GB/T 7568.2—2008《紡織品 色牢度 試驗標(biāo)準(zhǔn)貼襯織物 第2部分：棉和粘膠纖維》要求的棉標(biāo)準(zhǔn)貼襯織物，至于沸水中高溫蒸煮30～40 min，浴比1︰100，室溫下用大量蒸餾水洗滌2次，每次5～10 min。在通風(fēng)處自然懸掛晾干，制成5 mm×5 mm大小的碎片，稱取(0.75±0.05) g作為一份試樣，用小紙片包好。121 ℃，103 kPa滅菌15 min，備用[5]。經(jīng)處理的棉織物不含雜質(zhì)、無油污且具有良好的外觀吸水性。

1.2.3 菌種活化與擴(kuò)培菌液OD600值測定

活化：菌種用甘油凍存[6]。按照FZ/T 73023—2006《抗菌針織品》中相關(guān)條款進(jìn)行菌種活化。甘油凍存菌種轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)肉湯于37 ℃培養(yǎng)18～24 h；劃轉(zhuǎn)平板培養(yǎng)24～48 h(在冰箱中保存不超過5 d)；取營養(yǎng)肉湯20 mL放入100 mL三角瓶中，用接種環(huán)從已培養(yǎng)的平皿中挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，(37±1)℃，130 r/min，振蕩培養(yǎng)(18±1) h。菌液濃度達(dá)到1×109～5×109CFU/mL。

擴(kuò)培菌液OD600值的測定：按照1︰100的比例[7]，取上述活化菌液30 μL于30 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h時取菌液用比濁法測定菌液濃度OD 600值，記錄數(shù)值，精確到0.01。每個時間點(diǎn)重復(fù)測定4次。同時，取不同時間間隔菌液經(jīng)PBS緩沖液適當(dāng)稀釋后涂布，(37±1)℃培養(yǎng)24～48 h，計數(shù)。

1.2.4 接種菌液的準(zhǔn)備

大腸桿菌接種液：取經(jīng)3.5 h擴(kuò)培后OD600值大于0.6的大腸桿菌菌液1 mL用PBS緩沖液進(jìn)行3×10倍稀釋，充分混勻。

1.2.5 試驗有效性測試

“0”接觸時活菌數(shù)：在裝有70 mL PBS緩沖液的3個250 mL的錐形瓶中各加入備用標(biāo)準(zhǔn)空白試樣(0.75±0.05)g，然后各加入接種菌液5 mL。蓋上瓶蓋室溫振蕩1 min后，3個錐形瓶各取混勻的試液1 mL，經(jīng)2、3次10倍稀釋后各取1 mL于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布，每個稀釋度制作兩個平板作為平行樣。倒置平板，(37±1)℃培養(yǎng)24～48 h，計數(shù)[5]。此為“0”接觸時活菌數(shù)。

接觸18 h后活菌數(shù)：經(jīng)“0”接觸取樣后的標(biāo)準(zhǔn)空白試樣錐形瓶進(jìn)行封口后，24 ℃，150 r/min，振蕩18 h。振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，3個錐形瓶各取混勻的試液1 mL，經(jīng)3、4次10倍稀釋后各取1 mL于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布，每個稀釋度制作兩個平板作為平行樣。倒置平板，(37±1)℃培養(yǎng)24～48 h，計數(shù)[5]。此為接觸18 h后活菌數(shù)。

選擇菌落數(shù)在(30～300)CFU的合適稀釋度的平板計數(shù)。若最小稀釋倍數(shù)平板中的菌落<30，則按實(shí)際數(shù)量記錄；若無菌落生長，則菌落數(shù)記為“<1”。兩個平行平板的菌落數(shù)相差應(yīng)在15%以內(nèi)，否則此數(shù)據(jù)無效，應(yīng)重作試驗。

通過標(biāo)準(zhǔn)空白試樣細(xì)菌增長值(F)的計算判定試驗的有效性，即F≥1.0，試驗菌活性較強(qiáng)，試驗有效[5]。

F=lgWt-lgW0，其中Wt是試驗菌與標(biāo)準(zhǔn)空白試樣經(jīng)18 h接觸后，3個錐形瓶中試驗菌活菌濃度的平均值(CFU/mL)，W0是試驗菌與標(biāo)準(zhǔn)空白試樣“0”接觸后，3個錐形瓶中試驗菌活菌濃度的平均值(CFU/mL)。

實(shí)踐證明，國家的大政方針政策，在基層的貫徹落實(shí)是至關(guān)重要的。我們作為文化工作者，有責(zé)任有義務(wù)，把黨和國家的文化惠民政策，貫徹落實(shí)到廣大人民群眾中去。我們作為文化工作者，奮斗在一線，就要用我們的智慧和汗水，把文化這塊陣地守護(hù)好，培植好，澆灌好百花園中的每一朵健康美麗的花朵，為廣大人民群眾提供精神的芬芳，讓每個人都能夠享受到改革開放給我們帶來的物質(zhì)和精神成果。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種生長曲線與菌活性確定

大腸桿菌生長曲線：大腸桿菌(E.coli)擴(kuò)培OD600值測試記錄結(jié)果見表1。以擴(kuò)培時間為橫坐標(biāo)、4次重復(fù)試驗所得平均OD600值為縱坐標(biāo)作該試驗條件下E.coli的生長曲線，結(jié)果見圖1。如圖1(a)所示，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)3.5 h后，E.coliOD600值達(dá)到0.6左右，處于生長對數(shù)期[7]。

圖1 E.coli和S.aureus擴(kuò)培生長曲線Fig.1 The growth curves of E.coli or S.aureus after multiplication culture

表1 擴(kuò)培時間與大腸桿菌OD600值

金黃色葡萄球菌生長曲線：金黃色葡萄球菌(S.aureus)擴(kuò)培OD600值測試記錄結(jié)果見表2。以擴(kuò)培時間為橫坐標(biāo)、4次重復(fù)試驗所得OD600值的平均值為縱坐標(biāo)作該試驗條件下S.aureus的生長曲線，結(jié)果見圖1。如圖1(b)所示，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)3.0 h后，S.aureusOD600達(dá)到0.6左右。

表2 擴(kuò)培與金黃色葡萄球菌OD600值

該試驗條件下所得擴(kuò)增培養(yǎng)生長曲線顯示，E.coli和S.aureu經(jīng)過3.0～3.5 h擴(kuò)增培養(yǎng)后，試驗菌OD600值達(dá)到0.6左右，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)期生長期。此時，細(xì)胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時間呈直線關(guān)系。生長速率常數(shù)最大，即代時最短；細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致；代謝最旺盛。有相關(guān)文獻(xiàn)報道抗生素作用對該時期的細(xì)菌效果最佳[7-8]。因此，該試驗條件下，以擴(kuò)增培養(yǎng)3.0～3.5 h后試驗菌OD600值的大小作為細(xì)菌生長是否進(jìn)入對數(shù)期判定的依據(jù)，從而確保接種液中的細(xì)菌細(xì)胞處于細(xì)胞對數(shù)期，統(tǒng)一細(xì)胞生理狀態(tài)，由此減小不同試驗中不同批次的試驗菌生理狀態(tài)差異，即活性差異帶來的測試結(jié)果的不穩(wěn)定性和不可比性。此外，以擴(kuò)增培養(yǎng)3.0～3.5 h后的試驗菌OD600值初步確認(rèn)試驗菌細(xì)胞的活性。即，在該試驗條件下，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)3.5 h后，試驗菌OD600值小于0.5，則表明試驗菌活性不夠，需重新活化試驗菌。從而縮減進(jìn)一步通過有效性判定試驗確定試驗菌活性的試驗時間。

同時，平板計數(shù)結(jié)果顯示經(jīng)3～3.5 h擴(kuò)增培養(yǎng)后1 mL試驗菌菌液中的活菌數(shù)達(dá)到108CFU，E.coli和S.aureu經(jīng)過3.0 h擴(kuò)增培養(yǎng)后，菌液單位活菌數(shù)分別達(dá)到1.5×108、1.3×108CFU/mL。經(jīng)3次稀釋后即可達(dá)到接種液菌液濃度要求，即105CFU/mL。

2.2 試驗有效性判定

取上述3.5 h擴(kuò)增培養(yǎng)后OD600值達(dá)到0.6以上的菌液制備接種菌液進(jìn)行試驗有效性判定測試。多次重復(fù)試驗結(jié)果表明，該條件下的E.coli和S.aureus標(biāo)準(zhǔn)空白試驗菌增長值F≥1.0，試驗有效，見圖2。此外，在0.6～0.8，OD600值與增長值F存在一定的正相關(guān)，即OD600值越大，F(xiàn)值越大。由圖2(a)(b)比較可知，18 h培養(yǎng)后，S.aureus的試驗菌增長值較E.coli略小。分析原因:優(yōu)化條件下S.aureus的代時通常為27～30 min，而E.coli的代時通常為17 min[9]。但兩種測試用菌都能滿足試驗有效性判定的要求，即試驗菌增長值F≥1.0。由此也驗證了較E.coli，在S.aureus試驗接種菌的準(zhǔn)備中應(yīng)適當(dāng)?shù)卦黾訝I養(yǎng)肉湯量和接菌數(shù)量[5]，即不同于E.coli的3次PBS緩沖液10倍稀釋，S.aureus采用先2次營養(yǎng)肉湯10倍稀釋然后1次PBS緩沖液10倍稀釋，且稀釋后的接菌液中活菌數(shù)目確保在標(biāo)準(zhǔn)要求3×105～4×105CFU/mL的上限，由此可有效實(shí)現(xiàn)試驗菌增長值F≥1.0，確保試驗的有效性。

圖2 擴(kuò)增菌液OD600值與試驗菌活性值Fig.2 The correlation between OD600 value of multiplication culture solution and activity value of test bacteria

3 結(jié) 論

本文對紡織品抗菌性能測試中試驗菌種活性確定進(jìn)行了探討性研究。試驗結(jié)果表明，在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的二步預(yù)培養(yǎng)后，試驗菌通過3.5 h左右的擴(kuò)增培養(yǎng)，可使試驗菌處于生長的對數(shù)期。以此時的試驗菌作為接種菌，通過OD600值初步判定試驗菌的活性，從而有效確保后期試驗的有效性和測試結(jié)果的精確度。同時，研究表明經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后OD600值在0.6～0.8的細(xì)菌，后期標(biāo)準(zhǔn)空白試驗菌增長值F≥1.0，滿足試驗有效性判定。同時，標(biāo)準(zhǔn)空白試驗增長值F與OD600值存在一定的相關(guān)性，即OD600值越大，F(xiàn)值越大。

研究表明試驗菌活性的確定是抗菌檢測方法中的關(guān)鍵步驟，試驗菌活性的一致性是試驗結(jié)果具有可比性和重演性的基礎(chǔ)，高效、準(zhǔn)確的活性確定步驟是試驗結(jié)果快速、準(zhǔn)確的關(guān)鍵保障。進(jìn)一步深入、全面的探討和研究將最終實(shí)現(xiàn)抗菌測試技術(shù)達(dá)到與中國抗菌紡織品產(chǎn)業(yè)發(fā)展相稱的程度。

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《絲綢》參考文獻(xiàn)撰寫規(guī)范

來稿涉及的參考文獻(xiàn)需提供中英文對照，請按GB/T 7714-2005《文后參考文獻(xiàn)著錄規(guī)則》標(biāo)準(zhǔn)著錄，并在正文中標(biāo)出相應(yīng)序號，舉例如下：

1) 專著

[序號]主要責(zé)任者. 題名: 其他題名信息[文獻(xiàn)類型標(biāo)志]. 其他責(zé)任者(任選). 版本項. 出版地: 出版者, 出版年: 引文頁碼.

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2) 專著中的析出文獻(xiàn)

[序號]析出文獻(xiàn)主要責(zé)任者. 析出文獻(xiàn)題名[文獻(xiàn)類型標(biāo)志]. 析出其他責(zé)任者//專著主要責(zé)任者. 專著題名: 其他題目信息. 版本項. 出版地: 出版者, 出版年: 析出的頁碼[引用日期].

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3) 連續(xù)出版物(期刊、報紙)中的析出文獻(xiàn)

[序號]析出文獻(xiàn)主要責(zé)任者. 析出文獻(xiàn)題名[文獻(xiàn)類型標(biāo)志]. 連續(xù)出版物題名: 其他題名信息, 年, 卷(期): 頁碼.

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4) 專利文獻(xiàn)

[序號] 專利申請者或所有者. 專利題名: 專利國別, 專利號[文獻(xiàn)類型標(biāo)志]. 公告日期或公開日期.

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5) 電子文獻(xiàn)

[序號]主要責(zé)任者. 題名: 其他題名信息[文獻(xiàn)類型標(biāo)志/文獻(xiàn)載體標(biāo)志]. 出版地: 出版者, 出版年(更新或修改日期)[引用日期]. 獲取和訪問路徑.

例：[1]蕭鈺. 出版業(yè)信息化邁入快車道[EB/OL]. (2001-12-19)[2002-04-15]. http:∥www.creader. com/news/200112190019.htm.

XIAO Yu. Publishing industry informatization entering into the fast lane[EB/OL].(2001-12-19) [2002-04-15]. http:∥www.creader. com/news/200112190019.htm.

6) 標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)

[序號] 析出文獻(xiàn)主要責(zé)任者. 標(biāo)準(zhǔn)編號 標(biāo)準(zhǔn)名稱[S]// 專著主要責(zé)任者. 專著題名: 其他題目信息. 版本項. 出版地: 出版者, 出版年: 析出的頁碼.

例：[1] 國家標(biāo)準(zhǔn)局信息分類編碼研究所. GB/T 2659-1986 世界各國和地區(qū)名稱代碼[S] //全國文獻(xiàn)工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會. 文獻(xiàn)工作國家標(biāo)準(zhǔn)匯編: 3. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1988: 59-92.

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Study on Determining Activity of Bacterial Cells During Testing Antibacterial Property of Textiles

JIANG Jierong1, YANG Yao2, WANG Tiantian1, HUANG Lu2, HUANG Qiying1

(1.Jiangsu Textiles Quality Services Inspection Testing Institute, Nanjing 210007, China; 2.Ginling College of Nanjing Normal University, Nanjing 210027, China)

In order to shorten the test cycle used to determine test effectiveness of antibacterial property vibration test of fabrics, this paper discusses the relationship between the OD600 value of bacterium solution after timed multiplication culture and determination of test bacteria activity in antibacterial property test of fabrics. The research confirms the OD600 value of test bacteria after multiplication culture for 3.5 h as the index to evaluate the test bacterium activity in antibacterial property test. The results show that when the bacterium solution with OD600 value greater than 0.6 is used to prepare inoculant liquid, the growth value of standard blank test bacteriaF≥1.0, i.e. follow-up antibacterial property test experiment is effective; when OD600 value is between 0.6 and 0.8, greater OD600 value means largerFvalue; in other words, the results of follow-up antibacterial property test is more accurate.

textiles; antibacterial property; OD600 value; bacterial activity; test effectiveness

2014-06-16;

2014-12-01

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項目(KJ112514)

蔣潔蓉(1978-)，女，博士，高級工程師，主要從事紡織品安全性和功能性檢測研究。通信作者：黃啟英，高級工程師，huangqiying_09@163.com。

doi.org/10.3969/j.issn.1001-7003.2015.03.006

TS195.5

A

1001-7003(2015)03-0026-05 引用頁碼: 031106