枸杞多糖提取條件優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

汪琢　趙佳瑩　廖林等

摘要：為了優(yōu)化枸杞（Lycium chinense）中多糖的提取工藝并研究其抗氧化活性，以寧夏枸杞為原料，以水提醇沉為提取方法來研究其提取工藝。通過單因素試驗，考察不同料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提pH、提取次數(shù)、醇沉時間、醇沉時乙醇的加入量等諸多因素來優(yōu)化枸杞多糖的提取率；通過抗脂質(zhì)過氧化能力的測定以及對超氧陰離子自由基清除作用的測定對枸杞多糖的抗氧化能力進行研究。結(jié)果表明，在提取枸杞多糖時，料液比為1∶35（g∶mL），溫度為90 ℃，pH為11，浸提3 h，提取2次，合并提取液，加3倍體積95%乙醇沉淀6 h時，提取效果最佳，提取率為18.56%。另外，在提取時，采用超聲波輔助提取30 min，可提高多糖提取率?？寡趸Y(jié)果顯示，枸杞多糖具有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：枸杞（Lycium chinense）多糖；提??；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1；S567.1+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1440-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.040

Abstract：To optimize the process of extracting the polysaccharides from Chinese wolfberry and study its anti-oxidant， the ningxia wolfberry was sinked in water and extracted with alcohol method. Through single factor experiment， the different material liquid ratio， extraction temperature， extraction time， extraction of pH， extraction times and alcohol sink time， alcohol sink when， the amount of ethanol and extraction of auxiliary raw materials extracted in a different way， and many other factors were optimized. The single factor experiment， L9（34） orthogonal experiment and variance analysis was integrated. The phenol sulfuric acid method was used to measure polysaccharide yield. The effects of Lipid peroxidation and radical scavenging on superoxide were studied for testing the anti-oxidant activity. Results showed that the optimal LBP extraction conditions were the ratio of material to liquid of 1∶35（g∶mL）， 90 ℃， pH 11， 3 h leaching， extracting 2 times， merging the extracted liquid， adding 3 times 95% ethanol precipitation at 6 h. The extraction rate was 18.56% under these conditions. In addition， microwave assisted extraction for 30 min improved the polysaccharides yield. The Chinese wolfberry polysaccharides had good anti-oxidant activity.

Key words： Chinese wolfberry（Lycium chinense） polysaccharides ；extraction； anti-oxidant activity

枸杞（Lycium chinense）為茄科（Solanaceae）植物，是落葉小灌木，可食用及藥用的成熟果實被稱為枸杞或枸杞子。枸杞在全國各地均有野生，以寧夏、河北、甘肅及云南等地較多。寧夏產(chǎn)的皮薄肉厚，色澤艷紅，質(zhì)量優(yōu)良，久負盛名。枸杞是我國傳統(tǒng)的出口食品之一，遠銷港澳、東南亞、西歐及北美等地區(qū)和國家。枸杞的開發(fā)應(yīng)用，主要在于對枸杞子中枸杞多糖的開發(fā)，枸杞多糖是枸杞中主要有效成分之一，是從枸杞中提取而得的一種水溶性多糖。它是一種非特異性免疫增強劑，具有增強免疫力、抗癌、抗氧化、防衰老、增加造血功能、防止遺傳損傷等作用[1-5]。目前已確定該多糖系蛋白多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖成分組成。經(jīng)研究表明，枸杞多糖是枸杞子調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老的主要活性成分，可改善老年人易疲勞、食欲不振和視力模糊等癥狀，并具有降血脂、抗脂肪肝、抗衰老等作用[6-10]。所以枸杞多糖的開發(fā)無論在醫(yī)藥行業(yè)還是在食品行業(yè)都顯得尤為重要[11]。枸杞多糖可作為第三代功能性食品的功能因子，有很好的開發(fā)前景。目前對枸杞多糖的研究主要集中在枸杞多糖的結(jié)構(gòu)、藥理作用等方面，對枸杞多糖的生產(chǎn)工藝報道卻很少。本試驗對影響枸杞多糖的提取因素進行了較為系統(tǒng)的研究，優(yōu)化了提取條件，旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)或其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮枸杞采集于遼寧省撫順市枸杞種植基地，干燥粉碎后陰涼處保存。乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、石油醚等均為分析純。721G型可見光分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-40B型低速臺式大容量離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；JD100-3 型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；SHZ-D（Ⅲ） 型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；GFL-70型電熱鼓風干燥箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；FW-100型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；MM720KG1-PW型微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝路線 枸杞→烘干粉碎→脫脂除蛋白 →浸提→離心→取上清液減壓濃縮→乙醇沉淀→ 離心→取沉淀干燥測干重→復(fù)溶→定容→測多糖提取率。

1.2.2 多糖含量的測定方法

1）質(zhì)量比法。把烘干得到的枸杞粗多糖精確稱量，再根據(jù)樣品重量，按照下式計算出多糖提取率。

提取率=m/M×100%

式中，m-枸杞粗多糖質(zhì)量（g）；M-樣品總質(zhì)量（g）。

2）硫酸-苯酚法。把烘干得到的枸杞粗多糖加去離子水溶解，再轉(zhuǎn)入容量瓶中定容，以葡萄糖為標準品繪制標準曲線，將定容后的枸杞多糖溶液、苯酚溶液、濃H2SO4依次按比例加入，靜置10 min后振蕩，冷卻后在波長490 nm下測吸光度，根據(jù)標準曲線，按照下式計算出多糖提取率。

提取率=P·V·F/m×100%

式中，P-供試溶液中葡萄糖的濃度（mg/mL）；V-供試溶液的總體積（mL）；m-樣品總質(zhì)量（g）；F-換算因子。

1.2.3 單因素試驗 稱取枸杞樣品5份，每份均為10 g，考察料液比（g∶mL，下同）分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；浸提溫度分別為60、70、80、90、100 ℃；浸提時間分別為1、2、3、4、5 h；浸提pH分別為5、7、9、11、13；浸提次數(shù)分別為1、2、3、4；加3倍95%乙醇沉淀時間分別為2、4、6、8 h；醇沉時乙醇加入量分別為原液的1、2、3、4倍時測定多糖提取率。

1.2.4 預(yù)處理方法選擇 稱取枸杞樣品5份， 每份均為10 g， 按料液比為1∶30，pH為7，水提溫度為90 ℃，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為11，再分別用微波和超聲波輔助預(yù)處理30 min，提取2 h，提取2次，合并提取液，加入3倍95%乙醇沉淀6 h，測定多糖提取率。

1.2.5 優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，再以料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提pH為影響因素，做4因素3水平的正交試驗，以多糖提取率為測量指標。因素與水平見表1。

1.2.6 枸杞多糖抗氧化試驗

1） 枸杞多糖抗脂質(zhì)過氧化試驗。取1 mL大豆卵磷脂溶液、1 mL 0.4 mol/L 的FeSO4 溶液、1 mL 異嗪皮啶溶液依次加入試管中，混勻。于37 ℃避光水浴60 min，加入2 mL TCA-TBA鹽酸 混合液（15 g TCA、0.37 g TBA、2.1 mL 濃鹽酸，定容至100 mL），90～100 ℃水浴15 min，迅速冷卻，以3 000 r/min 離心10 min， 以去離子水為陰性對照，取上清液在535 nm波長處測定吸光度（As）[8]。抑制率計算公式如下：

抑制率=（Ac-As）/Ac×100%

式中，As為樣品的吸光度；Ac為不含樣品的吸光度。

2）枸杞多糖清除超氧陰離子自由基試驗。用鄰苯三酚自氧化法測定清除超氧陰離子自由基的能力。取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），4.2 mL去離子水，混勻后于25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入0.3 mL 3 mmol/L鄰苯三酚（以10 mmol/L HCl配制，25 ℃水浴預(yù)熱），迅速混勻后立即倒入比色皿，（注：空白管以10 mmol/L HCl代替3 mmol/L鄰苯三酚）在319 nm波長下測定吸光度Ai。加入不同濃度的樣品，再按上述方法依次加入其他試劑，用去離子水定容至1 mL，進行測量，按下面公式計算試液清除率。以相同濃度的維生素C為陽性對照，每個樣品重復(fù)測定3次。清除率計算公式[11]為：

P=（Ac-Ai）/Ac×100%

式中，Ai為加入樣品的吸光度；Ac為對照的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比 不同料液比對多糖提取率的影響結(jié)果見圖1。由圖1分析可知，隨著溶劑的增加，多糖提取率增加。但料液比由1∶30降低到1∶35時，多糖提取率的增加幅度不大，同時考慮到水量過大，多糖濃度被稀釋，反而加大后續(xù)過程的難度，增加能耗，因此初步確定料液比為1∶30較好。

2.1.2 浸提溫度 不同浸提溫度對多糖提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2分析可知，在60～70 ℃多糖提取率明顯增大，之后也有所增加，但增加緩慢，為了節(jié)約資源，故認為浸提溫度為90 ℃提取效果最好。

2.1.3 浸提時間 不同浸提時間對多糖提取率的影響結(jié)果見圖3。由圖3分析可知，浸提時間在1～2 h內(nèi)對多糖提取率的影響較大，之后隨著提取時間的延長，多糖提取率幾乎不再增加，故認為浸提時間為2 h時提取效果最好。

2.1.4 浸提pH 不同pH對多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。由圖4分析可知，不同的浸提pH對多糖提取率影響較大，隨著pH的增加，多糖提取率顯著增加，但增加到11時趨于平穩(wěn)，故認為當pH 11時提取效果最好。

2.1.5 浸提次數(shù) 不同浸提次數(shù)對多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5分析可知，提取次數(shù)為1～2時對多糖提取率的影響較大，之后隨著提取次數(shù)的增加，多糖提取率不再增加，故認為提取次數(shù)為2時提取效果最好。

2.1.6 醇沉時間 不同醇沉時間對多糖提取率的影響結(jié)果見圖6。由圖6分析可知，不同的醇沉時間對多糖提取率影響較大，隨著醇沉時間的延長，多糖提取率逐漸增加，直到醇沉6 h時趨于平穩(wěn)，故認為當醇沉時間為6 h時提取效果最好。

2.1.7 醇沉時乙醇的加入量 醇沉時不同乙醇的加入量對多糖提取率的影響結(jié)果見圖7。由圖7分析可知，醇沉時不同的乙醇加入量對多糖提取率影響較大，隨著乙醇的增加，多糖提取率逐漸增加，直到加入3倍原液的乙醇時趨于平穩(wěn)，故認為當醇沉時加入3倍原液的乙醇提取效果最好。

2.1.8 輔助方法 不同的輔助提取方法對多糖提取率的影響結(jié)果見圖8。由圖8可知，超聲波輔助提取可以提高多糖提取率。微波提取主要是利用微波輻射透過提取劑到達物料的內(nèi)部細胞，細胞內(nèi)的水分子等極性物質(zhì)吸收微波能產(chǎn)生大量的熱，使細胞內(nèi)的溫度迅速升高，水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，表面出現(xiàn)裂紋，使得胞外溶劑進入細胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)多糖物質(zhì)。而超聲波通過其機械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和許多次級效應(yīng)，如乳化、擴散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等極大限度地使物料細胞破碎，使其胞內(nèi)物質(zhì)幾乎全部溶出，這樣就使得提取率大大增加。

2.2 優(yōu)化試驗結(jié)果

通過單因素試驗的篩選，可知不同料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提pH對枸杞多糖提取率有顯著影響。為更進一步得出提取的最優(yōu)條件，以這4個單因素選3個水平，以提取率為考察指標，采用L9（34）正交試驗，結(jié)果與分析見表2。從表2可以看出，影響提取率的4個因素順序為浸提pH>浸提溫度>浸提時間>料液比。由極差分析得出，枸杞多糖提取工藝最佳組合為A2B2C3D2，即浸提溫度90 ℃，浸提時間3 h，料液比1∶35，pH 11。方差分析結(jié)果表明，枸杞多糖提取工藝優(yōu)化因素對提取率有顯著影響，但沒有極顯著影響。按以上正交試驗分析得到的最優(yōu)的條件為浸提溫度90 ℃，浸提時間3 h，料液比1∶35，pH 11進行3組平行試驗，得到的枸杞多糖提取率為18.56%。

2.3 枸杞多糖抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1 枸杞多糖抗脂質(zhì)過氧化試驗結(jié)果 卵磷脂可被·OH氧化損傷產(chǎn)生丙二醛（MDA）類似物，硫代巴比妥酸（TBA）可與MDA類似物反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532 nm處有最大光吸收。通過測定加有枸杞多糖的待測液在532 nm的吸光度，即可檢測枸杞多糖的抗脂質(zhì)過氧化能力。結(jié)果表明，枸杞多糖對脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用。在濃度為1 mg/mL時，抑制率為20.15%，其抑制作用與0.2 mg/mL維生素C一致。

2.3.2 枸杞多糖清除超氧陰離子自由基作用 不同濃度枸杞多糖對超氧陰離子自由基的清除作用見圖9。由圖9可知，不同濃度的枸杞多糖具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，并隨著濃度的增加，清除率不斷提高。當陽性對照維生素C的濃度為0.2 mg/mL的時候，對超氧陰離子自由基的清除率可以達到75.16%，與維生素C相比，枸杞多糖清除超氧陰離子自由基的能力不及維生素C，但也具有一定的清除能力。

3 小結(jié)與討論

通過正交試驗方法確定了從枸杞中提取多糖的最佳工藝為料液比1∶35、溫度90 ℃、pH 11，浸提3 h、提取2次，合并提取液，加3倍95%乙醇沉淀6 h時，多糖的提取率為18.56%；枸杞多糖的抗脂質(zhì)過氧化能力試驗表明，枸杞多糖對脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用，并且對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，并隨著濃度的增加，清除率不斷提高。目前，枸杞產(chǎn)業(yè)已進入多元化發(fā)展軌道，在對枸杞的諸多開發(fā)應(yīng)用中，枸杞多糖的開發(fā)受到人們的高度關(guān)注，無論是其藥用價值還是保健品的開發(fā)。本試驗對枸杞多糖的提取條件進行優(yōu)化并對其抗氧化活性進行研究，可對我國進一步研究枸杞資源提供理論參考。

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