李 霖，劉 冰，陳秀潤(rùn)，崔朝宇，蔣軍喜*，胡瓊波*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510510)

玫煙色棒束孢(Isaria fumosorosea)(又稱玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus)是一類分布廣泛的昆蟲病原真菌，也是目前已知頗具應(yīng)用前景的溫室害蟲生防真菌之一［1－2］;在國(guó)外已有PreFeRal、PF97等多個(gè)玫煙色棒束孢生防藥劑登記注冊(cè)［3－4］。然而從昆蟲尸體上分離篩選出的野生菌株往往由于防效不穩(wěn)定、毒力易退化等原因，限制了其田間的實(shí)際應(yīng)用［5－6］。因此，需進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌株，采用細(xì)胞工程、基因工程等多種生物技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良，進(jìn)而獲得高效工程菌株，為開發(fā)玫煙色棒束孢殺蟲劑提供一種有效的途徑。

外源基因轉(zhuǎn)化是進(jìn)行玫煙色棒束孢基因工程改良的關(guān)鍵步驟之一，其前提條件是能獲得該菌大量原生質(zhì)體細(xì)胞和具有高效的基因轉(zhuǎn)化方法。目前較為常見的基因轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體－PEG法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法［7］、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、限制酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法［8］、電轉(zhuǎn)化法［9］等，其中應(yīng)用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)建多采用原生質(zhì)體－PEG法，并且該方法已在若干實(shí)驗(yàn)菌株中成功應(yīng)用［10－11］。

2012年，本實(shí)驗(yàn)室研究人員從田間煙粉虱(Bemisia tabaci)尸體上分離到一株蟲生真菌(Isaria fumosorosea)，命名為菌株IfB01，前期實(shí)驗(yàn)表明該菌株對(duì)煙粉虱有較強(qiáng)的毒力［12］，考慮到其良好的生防應(yīng)用前景，本研究擬采用原生質(zhì)體－PEG法構(gòu)建起玫煙色棒束孢IfB01菌株外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并對(duì)其原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步探索，為下一步利用細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與含有外源基因載體 玫煙色棒束孢(Isaria fumosorosea)IfB01菌株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥毒理實(shí)驗(yàn)室提供，pSilent－1質(zhì)粒由美國(guó)FGSC中心惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑及配制 (1)試劑:不同濃度的NaCl滲透壓穩(wěn)定劑溶液;(2)蝸牛酶(Snailase)、纖維素酶(Cellulase)分別購(gòu)自BBI公司和Worthington公司，按試驗(yàn)要求稱取一定量的酶溶于配制的特定濃度的穩(wěn)滲劑中，經(jīng)0.45 μm細(xì)菌濾器過濾除菌，4℃下保存?zhèn)溆?(3)潮霉素B購(gòu)自Roch公司;(4)NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、NaCl、蛋白胨、蔗糖等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)改良的察氏培養(yǎng)基:蛋白胨 5 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊脂 15～20 g，加蒸餾水至 1 L;(2)液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基:改良的察氏培養(yǎng)基中不加瓊脂;(3)原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基:改良的察氏培養(yǎng)基加入相應(yīng)的滲透壓穩(wěn)定劑;(4)原生質(zhì)體保存 STC 培養(yǎng)液:1.2 mol/L 山梨醇，10 mmol/L Tris－HCl(pH 7.5)，50 mmol/L CaCl2;(5)PTC 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:PEG4000，10 mmol/L Tris－HCl(pH 7.5)，50 mmol/L CaCl2。

1.2 方 法

原生質(zhì)體制備參照Yoo［13］和李麗花等［14］的方法并作適當(dāng)修改。

1.2.1 菌絲體制備 玫煙色棒束孢IfB01菌株于改良的察氏培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2周;待產(chǎn)孢后，用0.05%的吐溫－80溶液沖洗平板，并配制成濃度為108個(gè)/mL的孢子懸浮液;取1 mL懸浮液接種于100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于25℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)30 h;無菌條件下，用雙層紗布將菌絲過濾至100 mL離心管中;5 000 r/min，離心10 min，棄上清;用0.7 mol/L的NaCl溶液清洗2遍;并用無菌紙吸干沉淀，得到幼嫩菌絲體。

1.2.2 原生質(zhì)體制備條件初探 (1)酶液配比。分別配制不同質(zhì)量濃度的蝸牛酶、纖維素酶，然后按照等體積混合原則進(jìn)行組合，共進(jìn)行7種組合處理，分別是3%蝸牛酶、3%纖維素酶、1%蝸牛酶+2%纖維素酶、1.5%蝸牛酶+1.5%纖維素酶、2%蝸牛酶+1%纖維素酶、2%蝸牛酶+4%纖維素酶、4%蝸牛酶+2%纖維素酶7種酶解液，將酶解液按1 g/mL的量加入到幼嫩菌絲體中，進(jìn)行酶解，制備原生質(zhì)體。7種處理在同一試驗(yàn)中完成，以減少誤差。在7種不同處理中，除酶種類不同外，其他試驗(yàn)條件均相同:以0.7 mol/L的NaCl溶液為滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度30℃、酶解pH6.0、在100 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩酶解，每隔2 h在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體數(shù)量，直至酶解10 h。然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量(每mL酶液產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量，以原生質(zhì)體個(gè)數(shù)/mL表示，下同)。(2)酶解時(shí)間。設(shè)定5個(gè)酶解時(shí)間:2，4，6，8，10 h。除酶解時(shí)間不同外，其他試驗(yàn)條件均相同:以1%蝸牛酶+2%纖維素酶作為酶解液，0.7 mol/L的NaCl溶液為滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度30℃、酶解pH6.0、在100 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩酶解。在設(shè)定的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)定時(shí)取樣，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。(3)酶解溫度。分別設(shè)定5個(gè)酶解溫度:26，28，30，32，34℃。除酶解溫度不同外，其他試驗(yàn)條件同步驟(2)。在設(shè)定的不同溫度下酶解8 h。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。(4)酶液pH值。分別配制pH值5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的0.2 mol/L磷酸緩沖液，在緩沖液中加入NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，NaCl溶液的終濃度為0.7 mol/L，然后配制1%蝸牛酶和2%纖維素酶混合液，除酶液pH值不同外，其他試驗(yàn)條件同步驟(2)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。(5)滲透壓穩(wěn)定劑濃度。將供試的NaCl滲透壓穩(wěn)定劑分別設(shè)定 5 個(gè)濃度:0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mol/L。除滲透壓穩(wěn)定劑濃度不同外，其他試驗(yàn)條件同步驟(2)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。(6)轉(zhuǎn)速。分別設(shè)定5個(gè)不同轉(zhuǎn)速條件:0，50，100，150，200 r/min。除振蕩轉(zhuǎn)速不同外，其他試驗(yàn)條件同步驟(2)。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，分別計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

1.2.3 原生質(zhì)體的純化 菌絲酶解后，用4層滅菌的擦鏡紙過濾混合液;將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min;棄上清，0.7 mol/L的NaCl溶液沖洗2次;再用10 mL STC溶液洗滌1次;在離心管中加入1 mL STC溶液，輕輕混合均勻;用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選 在上述原生質(zhì)體溶液中加入10 μL pSilent－1質(zhì)粒，輕輕混合均勻;4℃冰箱內(nèi)放置1 h;然后逐滴加入200 μL PTC溶液，室溫放置20 min;再逐滴加入800 μL PTC溶液，放入搖床中輕搖20 min;在離心管內(nèi)加入5 mL液體再生培養(yǎng)基，置于25℃，150 rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜;將過夜的培養(yǎng)液離心，棄部分上清，并將培養(yǎng)液中原生質(zhì)體濃度稀釋至104個(gè)/mL;取200 μL培養(yǎng)液(含原生質(zhì)體濃度1×104個(gè)/mL)涂于含有200 μg/mL潮霉素B的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基平板上，25℃條件下培養(yǎng)30 h，記錄平板上菌斑數(shù)，并計(jì)算原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落即為轉(zhuǎn)化子。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式:

轉(zhuǎn)化率=再生菌落數(shù)/涂布原生質(zhì)體個(gè)數(shù)×100%(1)

1.2.5 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 分別配制含20%、30%、40%、50%的 PEG4000的 PTC溶液，按照1.2.4方法分別進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，統(tǒng)計(jì)各濃度下再生菌斑數(shù)，并計(jì)算各濃度下原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫煙色棒束孢原生質(zhì)體制備條件初探

2.1.1 酶液配比對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 真菌細(xì)胞壁成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，選擇合適的酶系統(tǒng)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量具有重要影響。為篩選到理想的酶組合，選用2種常用酶(蝸牛酶和纖維素酶)及其組合進(jìn)行試驗(yàn)，觀察其對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，單獨(dú)進(jìn)行纖維素酶或蝸牛酶處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量相差不大，但2種酶混合使用效果明顯好于單個(gè)酶處理。當(dāng)混合酶系統(tǒng)中蝸牛酶∶纖維素酶=1∶2，酶的總濃度為30 mg/mL時(shí)，其原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，可達(dá)6.72×106個(gè)/mL。因此，玫煙色棒束孢菌株IfB01細(xì)胞壁的最適溶解酶系統(tǒng)為1%蝸牛酶+2%纖維素酶。

中共十九大報(bào)告指出：“我國(guó)社會(huì)主要矛盾已經(jīng)轉(zhuǎn)化為人民日益增長(zhǎng)的美好生活需要和不平衡不充分的發(fā)展之間的矛盾?！盵1]11美好生活理念的出場(chǎng)是對(duì)新時(shí)代美好生活需要的現(xiàn)實(shí)回應(yīng)，也是人民對(duì)美好生活憧憬的價(jià)值取向。但美好生活究竟是什么樣、美好生活何以成為人通達(dá)意義世界的棲息之地，仍然是一個(gè)有待深入探討的問題。鑒于此，本文擬從馬克思人的解放理論的視角切入，闡釋美好生活的內(nèi)涵和生成邏輯，以期為達(dá)成人民美好生活愿景提供理論坐標(biāo)和路徑參考。

表1 酶的種類及配比對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Tab.1 Effects of category of enzymes and mixture ratio on the protoplast yield of I.fumosorosea

2.1.2 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 對(duì)玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備的最佳酶解溫度進(jìn)行篩選，試驗(yàn)結(jié)果如圖1－A所示，開始時(shí)隨著酶解溫度的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸增加，酶解溫度為30℃時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量為最高，達(dá)到6.49×106個(gè)/mL，隨著酶解溫度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降逐漸下降。這一結(jié)果表明在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，復(fù)合酶的活性也在提高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也隨之增加;當(dāng)溫度過高時(shí)，復(fù)合酶的活性也會(huì)受到影響，進(jìn)而影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。

比較不同酶解時(shí)間對(duì)玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備的影響，結(jié)果如圖1－B所示，在供試時(shí)間內(nèi)，玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，至8 h為最高點(diǎn)，產(chǎn)量達(dá)到6.65×106個(gè)/mL，之后開始呈下降的趨勢(shì)，所以8 h玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備的最佳酶解時(shí)間。這一結(jié)果也表明酶解時(shí)間達(dá)到一定時(shí)間點(diǎn)后，酶解液會(huì)對(duì)菌株細(xì)胞膜造成破壞，進(jìn)而造成細(xì)胞消溶死亡，導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量下降。

2.1.3 酶解液pH值對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 由圖1－C可知，酶解液pH對(duì)玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備存在一定的影響，在供試的5個(gè)pH處理中，當(dāng)酶解液pH為6.0時(shí)，其原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為5.50×106個(gè)/mL;此外，酶解液 pH 為 7.0 時(shí)，其原生質(zhì)產(chǎn)量?jī)H為 4.03×106個(gè)/mL。

2.1.4 穩(wěn)滲液濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 穩(wěn)滲液濃度對(duì)玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體的產(chǎn)量有較大的影響，開始時(shí)原生質(zhì)產(chǎn)量隨著穩(wěn)滲液濃度的增大而增加，當(dāng)濃度為0.7 mol/L時(shí)，其產(chǎn)量達(dá)到最大值，為5.83×106個(gè)/mL;而后隨著穩(wěn)滲液濃度的進(jìn)一步增大，原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨之減少(圖1－D)。因此，玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備時(shí)，其穩(wěn)滲液最佳濃度為0.7 mol/L。

圖1 不同酶解條件對(duì)原生質(zhì)產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different digestion conditions on the protoplast yield of I.fumosorosea

2.1.5 酶解時(shí)振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 研究不同振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備的影響，結(jié)果表明不同的振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)IfB01菌株原生質(zhì)體制備影響差異較小，當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，其原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為6.07×106個(gè)/mL;其振蕩轉(zhuǎn)速設(shè)置為0，50，200 r/min時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量分別是5.35×106個(gè)/mL、5.74×106個(gè)/mL、5.59×106個(gè)/mL。由此，將 100 r/min 條件確定為玫煙色棒束孢菌原生質(zhì)體制備時(shí)最佳振蕩轉(zhuǎn)速條件。

2.2 玫煙色棒束孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.2.1 PEG4000濃度對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響 比較不同PEG4000濃度對(duì)玫煙色棒束孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如表2所示，當(dāng)PEG4000濃度為40%時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)7.05%;當(dāng)PEG4000濃度為20%時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率僅為2.1%。結(jié)果表明PEG4000濃度對(duì)玫煙色棒束孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率有較大影響，其原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化最優(yōu)PEG4000濃度為40%。

表2 PEG4000濃度對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響Tab.2 Effects of the concentration of PEG4000 to protoplast transformation

3 結(jié)論與討論

由于絲狀真菌細(xì)胞壁組成比較復(fù)雜，不同種屬之間存在一定的差異，因此，在原生質(zhì)體制備實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞壁酶解體系組成及濃度是影響原生質(zhì)體釋放的關(guān)鍵因素［15－16］。楊旭芬等［8］用蝸牛酶、裂解酶對(duì)玫煙色擬青霉Pfr116進(jìn)行酶解獲得成功，但其最優(yōu)原生質(zhì)體產(chǎn)量?jī)H為1.11×106個(gè)/mL。本試驗(yàn)比較了蝸牛酶、纖維素酶及其酶系組合對(duì)玫煙色棒束孢原生質(zhì)體的釋放效果，發(fā)現(xiàn)不同脫壁酶處理均能使玫煙色棒束孢釋放出原生質(zhì)，并且釋放效果存在明顯差異，多種酶組合比單種酶表現(xiàn)出更好的酶解效果，其中以1%蝸牛酶+2%纖維素酶酶解效果最好，其原生質(zhì)產(chǎn)量達(dá)6.72×106個(gè)/mL。此外，蝸牛酶、纖維素酶在其他絲狀真菌原生質(zhì)體制備實(shí)驗(yàn)中也被廣泛應(yīng)用，在本研究應(yīng)用中也表現(xiàn)出較好的酶解效果，玫煙色棒束孢在不同酶系處理后均無大量團(tuán)狀菌絲結(jié)構(gòu)殘存。

在原生質(zhì)體制備實(shí)驗(yàn)中，除細(xì)胞壁酶解體系組成及濃度外，影響原生質(zhì)體制備產(chǎn)量的因素還有菌絲菌齡、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH和穩(wěn)滲液的濃度等［15］。經(jīng)過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)滲液濃度對(duì)玫煙色棒束孢原生質(zhì)體的產(chǎn)量有較大的影響，當(dāng)穩(wěn)滲液濃度為0.7 mol/L時(shí)，其產(chǎn)量達(dá)到最大值，為5.83×106個(gè)/mL，這一試驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)滲液濃度變化會(huì)對(duì)玫煙色棒束孢細(xì)胞水分吸收造成影響，進(jìn)而影響其原生質(zhì)體產(chǎn)量，當(dāng)NaCl溶液濃度為0.7 mol/L時(shí)，其濃度與細(xì)胞內(nèi)離子濃度相差不大，能為其細(xì)胞提供穩(wěn)定的生存環(huán)境。

在PEG介導(dǎo)真菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，PEG濃度是影響其轉(zhuǎn)化效率的重要因素［11］。本試驗(yàn)比較了不同PEG濃度對(duì)玫煙色棒束孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，其濃度越高，介導(dǎo)效果越好，即轉(zhuǎn)化效率越高;但當(dāng)其濃度過高時(shí)，PEG的毒性可能殺死細(xì)胞，反而造成原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率降低。

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