王定鋒，李良德，李慧玲，張 輝，王慶森，吳光遠(yuǎn)

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)

茶大灰象甲(即柑橘灰象甲)Sympiezomiascitri屬鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae，是一種雜食性且為害大的農(nóng)業(yè)害蟲，常給茶樹、柑橘和油茶等多種經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失[1-2]。目前，在茶園和柑橘園中主要還是用化學(xué)防治方法來防控茶大灰象甲[3-7]，但化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用所引起的農(nóng)業(yè)“3R”(殘留、抗性、再度猖獗)問題，嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境和人類健康，正日益受到人們的關(guān)注。因此，有必要尋找綠色、高效的防治手段(如昆蟲病原真菌、病毒和寄生蜂等)來控制茶大灰象甲的發(fā)生危害。

棒束孢是一類重要的昆蟲病原真菌，可侵染多種農(nóng)林害蟲，該屬包含環(huán)鏈棒束孢Isariacateinannulata、細(xì)腳棒束孢I.Tenuipes、粉棒束孢I.cicadae和玫煙色棒束孢I.fumosorosea等多個(gè)種[8-9]。據(jù)Faria等報(bào)道，自上世紀(jì)60年代以來，有11種以棒束孢屬真菌為主要成份的真菌殺蟲制劑被開發(fā)、登記[10]。盡管棒束孢屬真菌具有巨大的生防潛力，但在其分類問題上卻存在較大的爭議。按照傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果棒束孢長期被劃分到擬青霉屬中[11]。而Luangsa-ard等應(yīng)用β-tubulin序列和rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并結(jié)合部分形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，重新將棒束孢列為一個(gè)屬[8]。分子標(biāo)記鑒定法能夠快速、有效、精準(zhǔn)的對(duì)不同真菌菌株進(jìn)行鑒定，受到了研究者的青睞。核糖體rRNA序列、EF1-α序列和ITS序列等分子標(biāo)記基因被廣泛應(yīng)用于昆蟲病原真菌的鑒定，并取得了較好的鑒定效果[12-16]。鑒于分子標(biāo)記鑒定法在昆蟲病原真菌鑒定中的強(qiáng)大優(yōu)勢，本研究通過對(duì)棒束孢If410的rDNA-ITS，EF1-α和β-tubulin等3個(gè)分子標(biāo)記基因的擴(kuò)增、測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，明確了寄生茶大灰象甲的棒束孢If410為玫煙色棒束孢。本研究結(jié)果將為今后更好地利用該菌防治茶大灰象甲及其它鞘翅目害蟲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株：棒束孢If410菌株分離自自然羅病死亡的茶大灰象甲成蟲，并用薩氏培養(yǎng)基Sabouraud dextrose agar plus 1% yeast extract(SDAY)試管斜面保存于4℃冰箱中。

1.2 培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基(SDAY)：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%瓊脂，pH 7.0。高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min。

SDY培養(yǎng)基為SDAY的液體形式，除了不添加瓊脂，其他成份、比例和滅菌條件同SDAY培養(yǎng)基。

1.3 棒束孢基因組DNA提取

把棒束孢孢懸液(1.0×106孢子·mL-1)接種到裝有10 mL SDY培養(yǎng)基的三角瓶(30 mL)中，用搖床25℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)4 d后刮取三角瓶內(nèi)壁的菌絲體。棒束孢菌絲的基因組DNA提取，直接參照Raeder和Broda方法[17]?；蚪MDNA提取后，用島津紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度，并直接用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

采用真菌通用引物ITS5 /ITS4[18]PCR擴(kuò)增菌株rDNA-ITS序列。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s；70℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；70℃延伸5 min。采用引物983F/1567R擴(kuò)增菌株translation elongation factor 1 alpha(EF1-α)序列[19]。PCR反應(yīng)參數(shù)參考Rehner和Buckley的方法[16]：94℃變性2 min，66℃退火1 min，70℃延伸1 min；接著9個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的退火溫度降低1℃；然后在36個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s；56℃退火30 s；70℃延伸1 min；最后70℃延伸10 min。采用bt2a/bt2b[20]PCR擴(kuò)增菌株β-tubulin序列。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火30 s；72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。擴(kuò)增rDNA-ITS序列、EF1-α序列和β-tubulin序列的3對(duì)引物序列詳見表1。3個(gè)序列的PCR反應(yīng)體系都為25 μL，即2×TaqMix 10 μL，棒束孢If410基因組DNA 1 μL，上下游引物(10 mmoL)各1 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。rDNA-ITS序列和β-tubulin序列PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化，直接送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。而EF1-α序列經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，先連接到T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，再送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。分別將rDNA-ITS序列、EF1-α序列和β-tubulin序列測序結(jié)果通過NCBI中Blast程序與在GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性分析。下載常見近緣種的相應(yīng)序列，分別用MEGA4.0軟件ClustalX方法進(jìn)行多序列比對(duì)，并以NJ法(neigbor-joining method)分別構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1000次[21]。

表1 菌株檢測的標(biāo)識(shí)序列引物Table 1 Primers for sequencing to identify test strains

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)標(biāo)記基因的擴(kuò)增結(jié)果

以ITS5/ITS4、983F/1567R和bt2a/bt2b 3對(duì)引物分別從棒束孢If410基因組DNA中擴(kuò)增出1條約600 bp的ITS片段、500 bp的EF1-α片段和大于300 bp的β-tubulin片段(圖1)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，ITS序列長度為589 bp，EF1-α序列長度為510 bp，菌株β-tubulin序列長度為330 bp。

圖1 棒束孢If410 3個(gè)分子標(biāo)記片段的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified from 3 molecular marker regions in If410注：1：EF1-α片段；2：ITS片段；3：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；4：β-tubulin片段

2.2 棒束孢If410的分子鑒定

通過Blast與GenBank中已有的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，與棒束孢If410的rDNA-ITS序列相似性達(dá)98%以上的大部分序列都是玫煙色棒束孢I.fumosorosea。為進(jìn)一步明確菌株If410與幾種常見棒束孢的親緣關(guān)系，分別選擇GenBank中已公布的爪哇棒束孢I.javanica、蟲草棒束孢I.farinosa、玫煙色棒束孢I.fumosorosea、高雄山蟲草Cordyceps takaomontana、細(xì)腳棒束孢I.tenuipes、粉棒束孢I.cicadae、環(huán)鏈棒束孢I.cateniannulata等的rDNA-ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明，棒束孢If410菌株的rDNA-ITS序列與玫煙色棒束孢I.fumosorosea聚集在一個(gè)最小的進(jìn)化分支上(Bootstrap值為97%)，并與其它棒束孢進(jìn)化距離較遠(yuǎn)(圖2)。在GenBank中與If410菌株的EF1-α序列相似性達(dá)98%以上的大部分序列都是玫煙色棒束孢I.fumosorosea。為進(jìn)一步明確菌株If410與幾種常見棒束孢的親緣關(guān)系，分別選擇GenBank中已公布的細(xì)腳棒束孢I.tenuipes、玫煙色棒束孢I.fumosorosea、環(huán)鏈棒束孢I.cateniannulata、爪哇棒束孢I.javanica、蟲草棒束孢I.farinosa、高雄山蟲草Cordyceps takaomontana、粉棒束孢I.cicadae等的EF1-α序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明，棒束孢If410菌株的EF1-α序列與玫煙色棒束孢I.fumosorosea聚集在一個(gè)最小的分支上(Bootstrap值為100%)(圖3)。在GenBank中與If410菌株的β-tubulin序列相似性達(dá)99%以上的大部分序列都是玫煙色棒束孢I.fumosorosea。為進(jìn)一步明確If410菌株與幾種常見棒束孢的親緣關(guān)系，分別選擇GenBank中已公布的細(xì)腳棒束孢I.tenuipes、粉棒束孢I.cicadae、玫煙色棒束孢I.fumosorosea、環(huán)鏈棒束孢I.cateniannulata、爪哇棒束孢I.javanica等的β-tubulin序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明，If410菌株的β-tubulin序列與玫煙色棒束孢I.fumosorosea聚集在一個(gè)最小的分支上(Bootstrap值為96%)(圖4)。綜合3個(gè)標(biāo)記基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果，我們判定棒束孢If410菌株為玫煙色棒束孢I.fumosorosea。

圖2 基于rDNA-ITS序列的If410菌株及棒束孢類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogeny of rDNA-ITS gene sequences of If410 and Isaria注：末端標(biāo)記為rDNA-ITS序列Genbank上的登錄號(hào)+菌株拉丁文，下同。

3 結(jié)論與討論

以往對(duì)昆蟲病原真菌的鑒定都是依靠形態(tài)學(xué)鑒定為主，該方法耗時(shí)費(fèi)力，而且鑒定的結(jié)果容易出現(xiàn)偏差。近年來，隨著GenBank數(shù)據(jù)庫中各種分子標(biāo)記基因序列的日益豐富，使得利用分子標(biāo)記來鑒定真菌、構(gòu)建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹的研究越來越便利。本研究利用ITS5/ITS4、983F/1567R和bt2a/bt2b 3對(duì)引物分別從玫煙色棒束孢If410中擴(kuò)增出ITS片段、EF1-α片段和β-tubulin片段，并對(duì)3個(gè)分子標(biāo)記基因進(jìn)行了測序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最終確定了該菌株為玫煙色棒束孢。該鑒定結(jié)果表明ITS片段、EF1-α片段和β-tubulin片段3個(gè)分子標(biāo)記基因可以有效的對(duì)棒束孢屬內(nèi)不同種進(jìn)行有效鑒定。本研究結(jié)果與D’Alessandro等[22]報(bào)道的EF1-α和ITS序列是改善棒束孢屬與其他昆蟲病原真菌特征、鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的有效工具較一致。

圖 3 基于EF1-α序列的If410菌株及棒束孢類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogeny of EF1-α gene sequences of If410 and Isaria

圖4 基于β-tubulin序列的If410菌株及棒束孢類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogeny of β-tubulin gene sequences of If410 and Isaria

雖然有報(bào)道發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌[23]和布氏白僵菌[24]對(duì)茶大灰象甲具有很高的殺蟲毒力，但當(dāng)前還未見玫煙色棒束孢寄生茶大灰象甲的相關(guān)報(bào)道。玫煙色棒束孢作為一種重要的昆蟲病原真菌，可侵染桃蚜[25]、煙粉虱[26]和象鼻蟲[27]等多種害蟲。自上世紀(jì)60年代以來，有10種以玫煙色棒束孢為主要成份的微生物制劑產(chǎn)品被開發(fā)、登記[10]。而本研究新鑒定出的茶大灰象甲寄生真菌為玫煙色棒束孢，進(jìn)一步豐富了茶大灰象甲殺蟲真菌的資源庫，為今后更好地利用玫煙色棒束孢防治茶大灰象甲及其它鞘翅目害蟲奠定基礎(chǔ)。