徐玉榮，劉啟方，廖文俊

Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路信號分子在黑素瘤中的表達(dá)

徐玉榮，劉啟方，廖文俊

徐玉榮

目的 探討Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路主要信號分子在正常人黑素細(xì)胞及不同黑素瘤細(xì)胞系中的激活狀態(tài)。方法 選取正常人原代黑素細(xì)胞（MC）及來源于原位（WM793B）、侵襲性（LIBR）及轉(zhuǎn)移性（SK-MEL-5）黑素瘤細(xì)胞系和色素痣、黑素瘤組織，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、激光共聚焦及免疫組化法檢測細(xì)胞及組織中該通路主要信號分子的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常人黑素細(xì)胞相比，在不同黑素瘤細(xì)胞系中該通路主要信號分子Wnt5a、散亂蛋白2(DVL2)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CN)、活化T細(xì)胞核因子2(NFAT2)、環(huán)氧合酶-2 (COX-2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A (VEGF-A)、黏著斑蛋白(vinculin)及波形蛋白(vimentin)明顯高表達(dá)，且Ca2+濃度較高；CN-B、NFAT2在色素痣中均為陰性表達(dá)，而在黑素瘤組織中多數(shù)呈陽性表達(dá)（P＜0.001）。在侵襲性及轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于原位黑素瘤。結(jié)論 在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路可能被激活，并在黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

黑素瘤；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；活化T細(xì)胞核因子； Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路

惡性黑素瘤（MM）是惡性程度高、容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的皮膚惡性腫瘤，其侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不完全清楚。有關(guān)Wnt5a-Ca2+信號通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，但其在黑素瘤發(fā)展過程中的精確調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及筆者試驗(yàn)組的前期研究，推測在黑素瘤細(xì)胞中存在一條Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路，并可能參與了黑素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。為此筆者選擇正常皮膚黑素細(xì)胞及來源于不同生長期的3株黑素瘤細(xì)胞系，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測該信號通路主要信號分子Wnt5a、散亂蛋白（DVL）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CN)、活化T細(xì)胞核因子2(NFAT2)、環(huán)氧合酶2 (COX-2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、黏著斑蛋白（vinculin）、波形蛋白（vimentin）的表達(dá)水平，再用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測這4株細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，最后用免疫組化檢測色素痣及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤臨床組織標(biāo)本中CN-B和NFAT2的表達(dá)，以探討Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路在不同發(fā)展期黑素瘤細(xì)胞中的激活狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及組織標(biāo)本 WM 793B、LIBR、SKMEL-5黑素瘤細(xì)胞為本科室儲存，原代黑素細(xì)胞由正常男性包皮環(huán)切組織分離、培養(yǎng)獲得；所有組織標(biāo)本均來源于西京醫(yī)院皮膚科，診斷結(jié)果均通過臨床、組織病理和免疫組化證實(shí)，蠟塊保存完好，臨床資料齊全。其中色素痣30例，原位、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黑素瘤各10例。

1.1.2 主要試劑 Dispase、254及K-SFM培養(yǎng)基（GIBCO），Trizol（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa合成，RIPA裂解液及BCA法蛋白含量檢測試劑盒（beyotime公司），一抗為兔抗人NFAT2抗體（cell signaling公司）及Wnt5a、CN-B、DVL2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin抗體（Abcam公司），二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)luo-3/AM（Invitrogen），AEC顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.1.3 主要設(shè)備 RNA定量儀（BECKMAN）、凝膠成像儀（Alphalmager）、PCR儀及電泳、轉(zhuǎn)膜器材（BIO-RAD）、激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司）

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取正常男性包皮組織，修剪掉包皮的血塊和皮下脂肪，0.01 mol/L無菌PBS 沖洗3次；置75%乙醇中浸泡50 s；剪成1 cm小長條，置入dispase中，4℃消化16 h；將表皮與真皮分離，將表皮剪碎后置入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）中，37 ℃消化 5 min，輕輕吹打5 min，加入含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；100目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，細(xì)胞混懸液1 000 r/min離心7 min，棄上清；用含青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，置入37 ℃、5%CO2孵箱中；2 h后棄上清，用角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)3 d，以抑制成纖維細(xì)胞生長；更換含5%胎牛血清的254培養(yǎng)基，以胰酶消化差速貼壁法純化細(xì)胞，S-100蛋白、Melan-A鑒定。

1.2.2 RT-PCR 根據(jù)Trizol說明書提取4種細(xì)胞總RNA。取上述RNA溶液2 μl 稀釋50倍進(jìn)行定量，A260/ A280值為1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s；51 ℃（CN）、54℃（DVL2）、56℃[Wnt5a、 NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]30 s；72 ℃ 30 s；33個循環(huán)；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。以GAPDH（21個循環(huán)）作為內(nèi)參照，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.3 Western blot 向大瓶內(nèi)細(xì)胞加入RIPA裂解液，裂解20 min，低溫離心后收集上清液，用BCA法蛋白含量檢測試劑盒定量，取適量總蛋白與其1/4體積5×上樣緩沖液混合后煮沸，配凝膠及電泳，轉(zhuǎn)膜，用封閉液稀釋一抗（1:1 000兔抗人Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin、?-肌動蛋白）4 ℃過夜，洗膜，用上述封閉液稀釋二抗（1:3 000羊抗兔IgG抗體）室溫2 h，發(fā)光。

1.2.4 正常人黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞中的Ca2+濃度檢測 常規(guī)傳代，按照每孔4×104的細(xì)胞密度將4株細(xì)胞放置于激光共聚焦專用的35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中（皿中間孔直徑為10 mm），加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h；完全貼壁生長后，加入120 μl測定液（Hank's BSS包括20 mmol/L HEPES、10 μmol/L Fluo-3/AM，pH7.4），置培養(yǎng)箱中孵育30 min；用Hank's BSS緩沖液輕洗細(xì)胞2次，加入1.5 ml含胎牛血清的DMEM，置培養(yǎng)箱中20 min； 室溫避光20 min，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光，選擇狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行拍攝，結(jié)果由Image-Proplus6.0軟件測定光密度值，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，然后采用LSD法進(jìn)行組間的兩兩比較。

1.2.5 免疫組化染色 常規(guī)脫蠟；滅活內(nèi)源性過氧化物酶；煮沸修復(fù)抗原；加入正常山羊血清封閉液；滴加兔抗人一抗，濕盒中過夜；先后滴加即用型免疫組化ELIVISIONTMPLUS試劑A及B；AEC顯色：棕色EP管先加入850 μl蒸餾水，再先后加入試劑A、B、C各50 μl，搖勻后加至切片室溫顯色，復(fù)染后AEC試劑封片。結(jié)果判定：利用Image-Pro軟件檢測陽性紅棕色染色面積，＜10%判定為陰性，＞10%判定為陽性，同時在所有陽性標(biāo)本中，按染色程度分為弱陽性及強(qiáng)陽性[1]。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果

Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin的mRNA在正常黑素細(xì)胞中均為低表達(dá)，而在原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中則有不同程度的高表達(dá)，但在不同生長期惡性黑素瘤細(xì)胞中并未呈現(xiàn)動態(tài)的變化趨勢（圖1）。

2.2 Western blot檢測結(jié)果

內(nèi)參照β-肌動蛋白相對分子質(zhì)量為43 000，Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin相對分子質(zhì)量分別為41 000、93 000、19 000、140 000、78 000、27 000、117 000和57 000。在檢測的4株細(xì)胞中，正常人黑素細(xì)胞均為低表達(dá)，而原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞的表達(dá)均顯著增強(qiáng)，但在不同生長期黑素瘤細(xì)胞之間并未呈現(xiàn)出動態(tài)的變化趨勢（圖2）。8個信號分子在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均有一致性。

圖1 Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號分子RT-PCR檢測結(jié)果

圖2 信號分子的Western-blot檢測結(jié)果

2.3 正常黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞中Ca2+濃度的檢測與正常人黑素細(xì)胞相比，WM793B、LIBR和SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度顯著增加，提示黑素瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增高，但未呈現(xiàn)出由正常皮膚黑素細(xì)胞、原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸增高的動態(tài)趨勢（圖3）。

2.4 免疫組化檢測不同標(biāo)本中NFAT 2和CN-B的表達(dá)NFAT 2表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為棕紅色著色顆粒，色素痣中NFAT 2蛋白均為陰性表達(dá)（0/30），而不同生長期黑素瘤中NFAT 2蛋白陽性表達(dá)率為63%（19/30）（原位、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黑素瘤組織陽性例數(shù)分別為2例、8例和9例；強(qiáng)陽性分別為0例、6例和7例），與色素痣的陰性表達(dá)相比，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（表2，圖4）。而CN-B主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。惡性黑素瘤中CN-B蛋白陽性表達(dá)率為67%（20/30）（原位、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黑素瘤組織陽性例數(shù)分別為3例、8例和9例；強(qiáng)陽性分別為0例、6例和7例），而在色素痣組織中CN-B蛋白均為陰性表達(dá)，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（表2，圖5）。

表2 色素痣及黑素瘤組織中NFAT2、CN-B的表達(dá) [例(%)]

圖3 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度

圖4 免疫組化檢測NFAT2表達(dá)結(jié)果（EliVision法）

圖5 免疫組化檢測CN-B表達(dá)結(jié)果（EliVision法）

3 討 論

Wnt信號通路是近年來備受關(guān)注的調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞生長、增生和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路在惡性黑素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用則成為近年來的研究熱點(diǎn)。NFAT是一組在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與機(jī)體生長發(fā)育和復(fù)雜的細(xì)胞相互作用，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞周期的演進(jìn)、生長和分化[2,3]。NFAT對細(xì)胞穩(wěn)定具有重要調(diào)控作用，這也使其具有致癌的潛能，如在胰腺癌等多種上皮性腫瘤以及腫瘤衍生細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)異常的NFAT亞型mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)[4,5]。NFAT的活化途徑為Wnt5a蛋白與細(xì)胞表面受體復(fù)合物結(jié)合后，即觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),活化細(xì)胞內(nèi)蛋白DVL2，繼而促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活CN，后者使NFAT脫磷酸化，向核轉(zhuǎn)位，與特定的DNA區(qū)域相結(jié)合，調(diào)節(jié)COX-2、VEGF、vinculin和vimentin等靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Juhász 等[6]發(fā)現(xiàn)，黑素瘤細(xì)胞系中CN的活性能夠被免疫抑制劑環(huán)孢素(CsA)所抑制，出現(xiàn)細(xì)胞代謝活性及增生率降低、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白結(jié)構(gòu)改變，最后增加死亡率，因而推測CN在黑素瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能方面起著較為重要的作用。Flockhart等[7]發(fā)現(xiàn)，NFAT2及NFAT4表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞系，NFAT作為COX-2的上游調(diào)控基因，可調(diào)控其蛋白表達(dá)及啟動子活性。筆者試驗(yàn)組的前期研究發(fā)現(xiàn)，COX-2蛋白在惡性黑素瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯升高，COX-2抑制劑塞來昔布和吲哚美辛均能顯著抑制惡性黑素瘤細(xì)胞的生長[8]。Wnt5a和Wnt11的基因表達(dá)水平在正常黑素細(xì)胞中表達(dá)較低，而在黑素瘤細(xì)胞中有不同程度的升高。利用鈣離子成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿對正常黑素細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度沒有顯著影響，而不同生長階段的黑素瘤細(xì)胞中鈣離子濃度顯著升高[9]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及筆者前期研究，推測在惡性黑素瘤細(xì)胞中可能存在一條Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路，該通路的激活可能參與了黑素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。為此，筆者首先對不同生長期的黑素瘤細(xì)胞中Wnt5a、DVL2、CN、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin 8個信號分子的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果為高表達(dá)，提示W(wǎng)nt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路在黑素瘤細(xì)胞中被激活。隨后應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)對該通路中的重要環(huán)節(jié)——鈣離子濃度進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)正常黑素細(xì)胞中Ca2+濃度較低，但在3株黑素瘤細(xì)胞中明顯增高，但信號分子的表達(dá)水平和Ca2+濃度在3株黑素瘤細(xì)胞之間并未呈現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的動態(tài)變化趨勢，考慮可能選擇的是體外培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞系，而且經(jīng)過長期的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞系的某些生物學(xué)性狀可能會發(fā)生改變。為驗(yàn)證Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路在黑素瘤活體組織中是否被激活及其與腫瘤發(fā)展過程的關(guān)系，又采用免疫組化對黑素瘤臨床標(biāo)本中的CN-B和NFAT2進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示色素痣中均為陰性表達(dá)，而在黑素瘤組織中CN-B和NFAT2多數(shù)呈陽性表達(dá)，且侵襲性及轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織中的陽性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度明顯高于原位黑素瘤組織。筆者認(rèn)為，在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路可能被激活，并可能參與了黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

[1] Yang GZ, Li L, Ding HY, et al. Cyclooxygenase-2 is over-expressed in Chinese esophageal squamous cell carcinoma, and correlated with NF-kappaB: an immunohistochemical study [J]. Exp Mol Pathol, 2005, 79(3):214-218.

[2] Caetano MS, Vieira-de-Abreu A, Teixeira LK,et al. NFATC2 transcription factor regulates cell cycle progression during lymphocyte activation: evidence of its involvement in the control of cyclin gene expression [J]. Faseb J , 2002, 16(14):1940-1942.

[3] Horsley V, Allprantis AO, Polak L, et al . NFATc1 balances quiescence and proliferation of skin stem cells [J]. Cell , 2008, 132(2):299-310. [4] Foldynová-Trantírková S, Sekyrová P, Tmejová K, et al. Breast cancer-specific mutations in CK1epsilon inhibit Wnt/beta-catenin and activate theWnt/Rac1/JNK and NFAT pathways to decrease cell adhesion and promote cell migration [J]. Breast Cancer Res, 2010, 12(3):R30.

[5] Duque J, Fresno M, Iniguez MA. Expression and function of the nuclear factor of activated T cells in colon carcinoma cells: involvement in the regulation of cyclooxygenase-2 [J]. J Biol Chem, 2005, 280(10):8686-8693.

[6] Juhász T, Matta C, Veress G, et al. Inhibition of calcineurin by cyclosporine A exerts multiple effects on human melanoma cell lines HT168 and WM35 [J]. Int J Oncol, 2009, 34(4):995-1003.

[7] Flockhart RJ, Armstrong JL, Reynolds NJ, et al. NFAT signalling is a novel target of oncogenic BRAF in metastatic melanoma [J]. Br J Cancer, 2009,101(8):1448-1455.

[8] 謝楊新, 廖文俊, 孫林潮, 等. 環(huán)氧合酶2在人惡性黑素瘤中高表達(dá)[J]. 中華皮膚科雜志, 2007, 40(2):100-103.

[9] Wang H, Yu YQ, Liao WJ, et al. Negative regulation of endogenous protein kinase Ca on the dynamic change of carbachol-induced intracellular calcium response in different melanoma cells [J]. J Cell Physiol, 2009, 221(2):276-282.

The expression of signaling molecules of Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT pathway in melanoma

XU Yu-rong，LIU Qi-fang，LIAO Wen-jun
Department of Dermatology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To investigate the expression of main signaling molecules of Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT signaling pathway in normal melanocytes and melanoma cells. Methods Expression of main signaling molecules was detected by laser confocal, immunohistochemistry, RT-PCR and Western blot in primary cultured melanocytes from healthy persons, WM793B, Libr, Sk-mel-5 melanoma cells, pigmented nevus and melanoma tissue. Results The expression of Wnt5a, DVL2, calcineurin, NFAT2, COX-2, VEGF-A, Vinculin and Vimentin was significantly higher in melanoma cells than in normal melanocytes. The result of Ca2+concentration was similar to the expression of those molecules. The expression of calcineurin-B and NFAT2 was positive in most melanoma tissues but negative in pigmented nevus (P＜0.001). The expression intensity of calcineurin-B and NFAT2 was significantly higher in invasive melanoma and metastatic melanoma than in melanoma in situ. Conclusion The Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT signaling pathway may be activated in melanoma and play a key role in invasion and metastasis of melanoma.

Melanoma；Calcineurin；Nuclear factor of activated T-cells；Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT pathway [J Pract Dermatol, 2015, 8(6):406-410]

R739.5

A

1674-1293(2015)06-0406-05

2015-06-28

2015-07-30）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150602

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院（徐玉榮，劉啟方，廖文俊）

徐玉榮，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：黑素瘤，E-mail: 1240496856@qq.com

廖文俊，E-mail: liaowj@fmmu.edu.cn