周 勇趙 瑋張 君

麻杏二三湯對哮喘小鼠氣道黏蛋白5ac mRNA影響的實驗研究

周 勇1趙 瑋2張 君3

目的 觀察麻杏二三湯對哮喘小鼠肺組織氣道黏蛋白（MUC）5ac mRNA的影響，探討其抑制哮喘小鼠氣道黏液高分泌的作用機制。方法 雌性BALB/c小鼠60只，隨機分成空白對照組、哮喘模型組、強的松組及麻杏二三湯高、中、低劑量組，每組10只。除空白對照組，另五組以腹腔注射0.1%卵白蛋白（OVA）與10%氫氧化鋁混懸溶液致敏，以1%OVA霧化液霧化攻擊制作哮喘小鼠模型。分別給予生理鹽水、生理鹽水、強的松（10.0mg/kg）、麻杏二三湯高劑量（30g/kg）、中劑量（15g/ kg）、低劑量（7.5g/kg）灌胃，R－T PCR測定各組MUC5ac mRNA表達。結(jié)果 麻杏二三湯高、中、低劑量組MUC5ac mRNA熒光定量△Ct值分別為（12.80±0.84）、（12.15±0.49）、（11.41±1.49），均高于哮喘模型組的（9.82±0.84）（P＜0.01）。結(jié)論 麻杏二三湯能夠有效抑制哮喘小鼠氣道黏液高分泌，其機制可能與其下調(diào)支氣管肺組織中MUC5ac mRNA表達有關。

小鼠；哮喘；MUC 5ac mRNA；麻杏二三湯

研究發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)作時氣道產(chǎn)生大量黏液，由于黏滯性較高較難被清除，與氣道痙攣協(xié)同引起氣道阻塞、氣流受限。致命性哮喘幾乎都有痰栓引起的氣道閉塞[1]。而氣道黏蛋白是決定哮喘氣道黏液量和黏滯性的內(nèi)在因素。本實驗通過觀察麻杏二三湯對哮喘小鼠肺內(nèi)MUC5ac mRNA表達的影響，探討麻杏二三湯抑制哮喘氣道黏液高分泌的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌性，上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013－0016。

1.2 藥物及試劑 麻杏二三湯（炙麻黃6g，杏仁、半夏各10g，化橘紅12g，茯苓15g，炒蘇子、萊菔子各10g，訶子、平地木各6g，白芥子、甘草各5g，購自杭州市紅十字會醫(yī)院中藥房，由浙江省中醫(yī)院制劑室水煎濃縮至生藥1g/mL；強的松片（浙江仙居制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號101107）；卵白蛋白（Sigma公司）；dNTP（TaKaRa公司，LOT:D4030A CBF49018）；loxbuffer（TaKaRa公司，LOT：A11101A）；rTaq（TaKaRa公司，LOT：DR100AM CK1201CB）；Marker（Tiangen公司，LOT：MD101 F5110）；Trizol（BioBasic Inc公司，LOT:BS409 40950732）；酚氯仿（Biotech公司，LOT：PD0419－1 0326S09）；逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司，LOT：D2640A CK101D）；Oligo clcTn8（TaKaRa公司，LOT：D511 CT401A）；SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司，LOT：DRR041A）。

1.3 主要儀器 定量PCR儀器：iQTM5多重實時熒光定量PCR儀（美國Bio－Rad公司）；臺式高速冷凍離心機（Eppendorf公司，型號Certrifuge5417R）；臺式低速離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號LX－300）；電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號DY89－Ⅱ）；電泳系統(tǒng)（Bio－RAD公司，型號Mini－Proten Tetra System）；凝膠成像儀（Bio－RAD公司，型號ChemiDoc XRS+System）。

2 實驗方法

2.1 模型建立 實驗組小鼠分別于實驗第0天及14天腹腔注射新鮮配制的0.1%卵白蛋白（OVA）與10%氫氧化鋁混懸溶液0.2mL（OVA 0.1mL+氫氧化鋁0.1mL）致敏，空白對照組予等量生理鹽水腹腔注射。實驗第21、22、23天將實驗組小鼠置于透明密閉箱中，以1%OVA霧化液按最大霧化量超聲霧化，小鼠自然吸入30min，每天1次，共3天；同時空白對照組相應予等量生理鹽水霧化。

2.2 分組及給藥 雌性BALB/c小鼠60只，按照完全隨機分組法分成空白對照組、哮喘模型組、強的松組及麻杏二三湯高、中、低劑量組，每組10只。于實驗第14天起開始分別給予生理鹽水、生理鹽水、強的松（10mg/kg）、麻杏二三湯（30g/kg）、麻杏二三湯（15g/kg）、麻杏二三湯（7.5g/kg），每天1次，連續(xù)給藥10天，從第21天始在激發(fā)前1h左右灌胃。

2.3 標本采集和制備 末次激發(fā)24h后腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2mL麻醉，開胸取肺，肺組織先放入液氮,后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 熒光定量PCR法測定各組小鼠肺組織中MUC5ac mRNA

2.4.1 引物設計 采用Primer 5.0和Beacon designer 7.8軟件進行定量PCR引物的設計，Mouse MUC5ac，基因序列號L42292.1，上游引物5'－GAGAGGAGGG TTTGATCTGTTTGA－3'，下游引物5'－GTGTGGTAAC TGAAGCTGTGGAA－3'，擴展長度120bp；Mouse 18S（內(nèi)參），基因序列號NR_003278，上游引物5'－CGGACACGGACAGGATTGACA－3'，下游引物5'－CCAGACAAATCGCTCCACCAACTA－3'，擴展長度94bp。均由上海生物工程有限公司負責合成。

2.4.2 RNA提取操作步驟 ①樣品處理：取出標本，液氮研磨，取50～80mg粉末加入1mL TRIzol混勻，室溫放置5min；②加入氯仿0.2mL，用力振搖，室溫放置2～3min；③最大轉(zhuǎn)速12 000g離心15min，吸取上層水相，移置另一離心管；④加入0.5mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；⑤4℃最大轉(zhuǎn)速12 000g離心10min，棄上清；⑥加入75%乙醇1mL，充分洗滌沉淀后于4℃、10 000g離心5min，棄上清，室溫干燥；⑦加入30～50μL RNase－Free Water，充分溶解后，加入DNase I進行消化，去除基因組DNA污染，分光光度計測定含量和純度。⑧RNA純度及濃度檢測：抽提總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以鑒定見圖，可見5s、18s和28s三條帶，說明RNA完整沒有降解，可作為逆轉(zhuǎn)錄反應的模板。取RNA抽提液2μL加98μL無RNA酶去離子水混勻，Du－640紫外分光光度儀測OD260/OD280，比值在1.8～2.0，檢測核酸濃度，計算核酸量。

2.4.3 cDNA合成操作步驟（可參考TAKARA RT試劑盒） ①短暫離心后，加入如下組分：5×第一鏈反應緩沖液 2μL、Oligo dT引物 0.5μL逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，總RNA 2μL，采用DEPC水補齊到10μL；②輕輕混勻后，混合物在37℃中放置20min；③85℃加熱15sec終止反應，至冰上進行后續(xù)試驗或冷凍保存。

2.4.4 PCR反應步驟 PCR反應體系：反應體系（25μL）：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O補充體積至25μL。PCR反應條件：95℃，1min；40個循環(huán)：95℃，10sec；64℃，25sec（收集熒光）；熔點曲線分析55℃to 95℃。

2.5 統(tǒng)計學方法 各個目的基因的表達水平以相對表達量△Ct進行分析。應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料比較用單因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 目的基因及內(nèi)參電泳圖 實驗結(jié)果顯示電泳條帶和設計的擴增條帶長度全部符合，見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

3.2 熒光PCR擴增效果 各個引物擴增均具有單一的熔點曲線圖，說明這些引物的熒光定量PCR擴增具有較強的特異性。見圖2～5。

圖3 Mouse 18s熔點曲線

圖4 Mouse MUC5ac擴增曲線

圖5 Mouse MUC5ac熔點曲線

3.3 Real－time定量PCR分析 對基因的表達水平以相對表達量△Ct值進行分析（ΔCt=C目的－Ct內(nèi)參）。哮喘模型組、強的松組、麻杏二三湯高、中、低劑量組MouseMUC5ac的△Ct值均低于空白對照組（P均＜0.01）；強的松組、麻杏二三湯高、中、低劑量組均高于哮喘模型組（P均＜0.01）；麻杏二三湯高劑量組高于麻杏二三湯低劑量組（P＜0.01）；麻杏二三湯中、低劑量組低于強的松組（P＜0.01）。見表1。

4 討論

氣道黏液高分泌是哮喘氣道重要的病理生理改變，也是導致哮喘高發(fā)病率和致死率的重要因素之一[2]。氣道黏液中含有大約2%的黏蛋白，黏蛋白是氣道黏液最主要的有形成分[3]，是一類由杯狀細胞和粘膜下腺體合成的高度糖基化的蛋白質(zhì)[4]，是決定黏液黏彈性和黏性的主要因素[5]。哮喘中氣道黏液過度分泌，該特征與黏蛋白基因的異常表達有關[6]。氣道黏蛋白分泌增加的直接后果是氣道內(nèi)黏液增加以及黏液性狀的改變，導致氣道狹窄加重、呼氣時細支氣管早期閉合以及氣道纖毛清除功能障礙[7]。目前已有21種黏蛋白在人類基因組中被識別[8]，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同分為膜結(jié)合型和分泌型。肺內(nèi)表達的黏蛋白有膜結(jié)合型MUC1、MUC3、MUC4、MUC11，分泌型MUC2、MUC5ac、MUC5b、MUC6b、MUC7b、MUC8b等。其中MUC5ac、5B是氣道內(nèi)主要的分泌型黏蛋白。在氣道表達的9種MUC中，MUC5ac是最主要的使氣道黏液凝膠性增強的MUC[3]。Groneberg等[9]研究發(fā)現(xiàn),致命性哮喘中MUC5ac、MUC5b的染色均加重，以MUC5ac染色為主。因此我們可以把MUC5ac作為哮喘氣道黏蛋白基因表達情況的研究對象。MUC5ac的變化最能有效的反映氣道黏液黏滯性的變化。

表1 各組大鼠肺組織MUC5ac mRNA熒光定量ΔCt值比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織MUC5ac mRNA熒光定量ΔCt值比較（±s）

注：與空白對照組比較，▲P＜0.01；與哮喘模型組比較，△P＜0.01；與麻杏二三湯低劑量組比較，*P＜0.01；與強的松組比較，■P＜0.01

組別空白對照組哮喘模型組強的松組麻杏二三湯高劑量組麻杏二三湯中劑量組麻杏二三湯低劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10 ΔCT值16.53±0.86 9.82±0.84▲13.45±0.81▲△12.80±0.84▲△* 12.15±0.49▲△■11.41±1.49▲△■

麻杏二三湯各劑量組MUC5ac mRNA表達較哮喘模型組減少，氣道黏液減少，抑制黏液高分泌。朱丹溪說：“哮喘專主于痰?！碧档漠a(chǎn)生主要在于臟腑陰陽失調(diào)，素體偏盛偏虛，對津液的運化失常，肺不能布散津液，脾不能輸化水精，腎不能蒸化水液，而致凝聚成痰，如伏藏于肺，則成為發(fā)病的潛在“夙根”。痰飲既為哮喘的內(nèi)因，又是推進哮喘發(fā)作、加重哮喘癥狀的病理因素。中醫(yī)認為，痰飲是津液代謝障礙的產(chǎn)物。麻杏二三湯是名老中醫(yī)焦樹德治療哮喘經(jīng)驗方，方中白芥子溫肺化痰，利氣散結(jié)；炒蘇子降氣化痰，止咳平喘；萊菔子消食導滯，下氣祛痰；訶子斂肺止咳，降火利咽；平地木化痰止咳，利濕，共奏化痰止咳，降氣平喘，理氣和胃之功。半夏辛溫性燥，能燥濕化痰，和胃降逆；化橘紅理氣行滯，燥濕化痰，兩者相輔相成，增強燥濕化痰之力，又能理氣和胃。麻黃辛溫，解表散邪，宣肺平喘；杏仁味苦，降氣平喘，化痰止咳，與麻黃一宣一降，調(diào)理肺氣。全方合用共奏宣降肺氣、健脾助運化痰逐飲、止咳平喘之功，契合哮喘痰氣交阻的病機。臨床報道其治療哮喘、喘證取得較好療效[10-11]，明顯改善患者咳嗽、咳痰、喘息癥狀，提高患者生活質(zhì)量。本組結(jié)果顯示，麻杏二三湯能夠抑制哮喘小鼠氣道黏液高分泌的機制可能與下調(diào)MUC5ac mRNA表達相關。

［1］張麗.氣道黏液高分泌疾病概述［J］.黑龍江醫(yī)學，2009，33（2）：105-108.

［2］Evans CM，Koo JS.Airway mucus：The good，the bad，the sticky［J］.Pharmacol Ther，2009，121（3）：332-348.

［3］Leikauf GD，Borchers MT，Prows DR，et al.Mucin apoprotein expression in COPD［J］.Chest，2002，121（5suppl）：166S-182S.

［4］Paul E，Lee DI，Hyun SW，et al.Identification and characterization of high molecular-mass mucin-like glycoproteins in the plasma membrane of airway epithelial cells［J］.Am J Respir Cell MolBiol，1998，（19）：681-690.

Effect of Maxing Ersan Decoction on Pulmonary Mucin MUC5ac mRNA Expression in Asthmatic Mice

ZHOU Yong1,ZHAO Wei2,ZHANG Jun3. 1 Department of Preventive Medicine,Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou (310003),China;2 Pulmonary Function Testing Room,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the influence of Maxing Ersan decoction on the expression of pulmonary mucin MUC5ac in asthmatic mice.Methods Sixty female BALB/c mice were randomly divided into 6 groups: blank control group,asthma model group,prednisone－treating group,and Maxing Ersan decoction groups（high－, middle－,and low－dose）,with 10 mice in each group.A fresh mixture of 0.1%ovalbumin（OVA）and 10%aluminum hydroxide suspension solution was intraperitoneally injected to sensitize and 1%OVA atomized liquid was used to induce asthma in 5 groups except blank control group.Mice in the corresponding group were given normal saline,normal saline,prednisone（10.0mg/kg）,Maxing Ersan decoction（7.5g/kg）,Maxing Ersan decoction（15g/kg）, Maxing Ersan decoction（30g/kg）by gavage.Real－time fluorescence quantitative polymerase chain reaction assay（RT－PCR）was used to detect the expression of MUC5ac mRNA in mice'lung tissue of each group.Results TheΔCt value of all Maxing Ersan decoction groups（12.80±0.84,12.15±0.49,11.41±1.49）were higher than that of asthma model group（9.82±0.84,P＜0.01).Conclusion Maxing Ersan decoction can effectively inhibit the asthmatic mice'airway mucus hypersecretion by downregulating the expression of MUC5ac mRNA.

mice；asthma；MUC5ac mRNA；Maxing Ersan decoction

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2010ZA096）

1杭州市紅十字會醫(yī)院干部保健科（杭州 310003）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院肺功能室（杭州 310006）；3浙江中醫(yī)藥大學（杭州 310053）

周勇，Tel：13216701315；E－mail：zhouyong_1976@163.com