張芮琪,陳正禮,羅啟慧
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川 雅安 625014)
近年來,健康養(yǎng)殖成為人們關(guān)注的問題,中草藥及其提取物因其來源廣泛、低毒及無耐藥性和無藥物殘留等優(yōu)勢(shì)成為替代抗生素,治療和預(yù)防畜禽動(dòng)物疾病的重要藥物。黃芪為豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根,具有補(bǔ)氣固表,利尿拔毒,排膿和斂瘡生肌等功效[1],為中醫(yī)臨床常用藥,有關(guān)其制劑及活性成分的藥理學(xué)研究一直受到重視。研究證實(shí),其化學(xué)成分主要含有多糖、黃酮、多種皂苷以及生物堿、氨基酸和亞油酸等。其中,黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)作為黃芪的主要有效成分,在調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要作用[2]。近年來,黃芪多糖因其顯著的免疫增強(qiáng)和抗病毒效應(yīng),加上來源豐富、價(jià)格低廉、較低的毒性以及無耐藥性等[3]特性而廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床、畜牧及水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中,其利用價(jià)值越來越受到重視。但目前在其對(duì)免疫抑制動(dòng)物的研究上還沒有系統(tǒng)的綜合性評(píng)價(jià)指標(biāo)與體系,因此本實(shí)驗(yàn)就黃芪多糖對(duì)正常和免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)及其組織形態(tài)學(xué)的影響進(jìn)行觀察,并從腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能和外周血T淋巴細(xì)胞亞群 CD3+、CD4+和CD8+百分含量?jī)蓚€(gè)方面研究黃芪多糖對(duì)正常小鼠及免疫抑制小鼠非特異性免疫及T淋巴細(xì)胞亞群的影響。一方面為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),另一方面也可為多糖類物質(zhì)免疫調(diào)控評(píng)價(jià)提供一套較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
120只5周齡SPF級(jí)KM小鼠,雌雄各半,體重(18±3)g,來源于成都達(dá)碩生物科技有限公司【SCXK(川)2013-24】。實(shí)驗(yàn)在雅安普萊美生物科技有限公司【SYXK(川)2014-186】進(jìn)行。在室溫22℃、控光條件下(14 h光照,10 h黑暗)按常規(guī)方式單籠飼養(yǎng),在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周后用于實(shí)驗(yàn),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的原則給予人道的關(guān)懷。
1.1.2 主要儀器設(shè)備
流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Altra,美國(guó)Beckman公司);Motic數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司);Leica RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)徠卡儀器設(shè)備公司),LS-100石蠟包埋機(jī)和GTK-2002自動(dòng)恒溫?cái)偪竞嫫瑱C(jī)(沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司),Sartorius AA-160型電子讀數(shù)分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司),數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6型(國(guó)華電器有限公司)等。
1.1.3 主要試劑
黃芪多糖(購(gòu)自陜西寶雞方晟生物開發(fā)有限公司)、環(huán)磷酰胺、FITC anti-mouse CD3+、PE antimouse CD4+、PE anti-mouse CD8+(均為美國(guó) BD 公司產(chǎn)品),肝素鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司),蘇木素、伊紅、瑞特氏染液等。
1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組
將小鼠隨機(jī)分為6組,每組20只:I組為對(duì)照組,II組為黃芪多糖低劑量組(100 mg/kg)、III為黃芪多糖高劑量組(500 mg/kg)、IV組為CTX免疫抑制模型組、V為CTX+黃芪多糖低劑量組、VI為CTX+黃芪多糖高劑量組。各組按相應(yīng)劑量灌胃中藥多糖,連續(xù)灌胃14d。其中,第 IV、V、VI三組以CTX致免疫抑制小鼠模型為基礎(chǔ)[于灌服多糖的第1天腹腔注射75 mg/(kg·bw)CTX,隔1天注射1次,共3次]。
1.2.2 黃芪多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)及組織發(fā)育的影響
末次給藥后24 h,各組隨機(jī)取6只小鼠稱重,而后處死小鼠,取其脾臟及胸腺分別稱重,并計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。稱重后的胸腺和脾臟組織均投入4%多聚甲醛中固定,按常規(guī)組織學(xué)方法制備石蠟切片,HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。
1.2.3 黃芪多糖對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響
按照參考文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。主要操作如下:在末次給藥前三天每組隨機(jī)選6只小鼠腹腔注射6%淀粉溶液1 mL,末次給藥后30 min,每組小鼠腹腔注射2 mL的1%雞紅細(xì)胞懸液,30 min后腹腔注射2 mL PBS緩沖液,按揉腹部3~5 min。頸椎脫臼法處死小鼠,酒精消毒,吸取腹腔液,制作腹腔巨噬細(xì)胞涂片,姬姆薩染色,鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞情況。按以下公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的總巨噬細(xì)胞數(shù) ×100%
吞噬指數(shù):吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的總巨噬細(xì)胞數(shù) ×100%
1.2.4 黃芪多糖對(duì)免疫抑制模型小鼠外周血CD3+、CD4+和 CD8+的影響
末次給藥后2 h,每組隨機(jī)選6只小鼠。對(duì)各組小鼠實(shí)行摘除眼球法采血,1%肝素鈉抗凝。取200 μL抗凝血加入抗體20 μL,充分混勻,震蕩,室溫避光20 min;加600 μL紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,震蕩避光10 min;離心1500 r/min,5 min,棄上清,加PBS緩沖液1 mL洗,以去除未結(jié)合抗體;離心沉淀后棄上清;加300 μL 1%多聚甲醛固定液重懸,置于4℃冰箱,于24 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.2.5 數(shù)據(jù)分析
結(jié)果見表1。由表1可以看出,與對(duì)照組相比,高劑量APS可顯著提高正常小鼠脾臟的器官指數(shù)(P<0.05),高、低劑量的APS均可極顯著提高正常小鼠的胸腺指數(shù)(P<0.01)。CTX模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均極顯著低于對(duì)照組,表明造模成功。與CTX模型組相比,低劑量APS可顯著提高CTX致免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.05),而高劑量APS可極顯著提高CTX致免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P<0.01)。
2.2.1 黃芪多糖對(duì)小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響
對(duì)照組脾臟被膜較厚,并伸入實(shí)質(zhì)形成小梁;脾臟實(shí)質(zhì)由紅髓和白髓組成,其界限分明,白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞較為密集。與對(duì)照組相比(圖1A),低、高劑量APS組脾臟白髓面積明顯增大,脾小結(jié)生發(fā)中心明顯,動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚,白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量更多(圖1B、C)。CTX組脾臟組織結(jié)構(gòu)雜亂,紅髓與白髓界限不清,白髓結(jié)構(gòu)散亂,脾小結(jié)明顯變小,淋巴細(xì)胞較為稀疏(圖1D)。CTX+低劑量APS組,脾臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善,紅髓與白髓界限逐漸分明,白髓面積增大、淋巴細(xì)胞變得密集(圖1E);CTX+高劑量APS組脾臟組織形態(tài)恢復(fù)情況更好,動(dòng)脈周圍淋巴鞘明顯增厚(圖1F)。
2.2.2 黃芪多糖對(duì)小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)的影響
對(duì)照組胸腺小葉分界清楚,皮質(zhì)與髓質(zhì)界限清晰,皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞較為密集(圖2A)。與對(duì)照組相比,低、高劑量APS組的小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)及小葉面積均有所增大,皮質(zhì)變厚(圖2B、圖2C)。CTX模型組胸腺小葉結(jié)構(gòu)不清,胸腺皮質(zhì)萎縮、其中淋巴細(xì)胞變得稀疏,髓質(zhì)區(qū)域明顯變大(圖2D)。CTX+低劑量APS組小鼠胸腺小葉結(jié)構(gòu)較為清晰,皮髓質(zhì)分界清楚,皮質(zhì)增厚(圖2E)。CTX+高劑量APS組胸腺組織結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn),皮質(zhì)明顯增厚、其中淋巴細(xì)胞密集(圖2F)。
如表1所示,與對(duì)照組相比,低、高劑量的APS均可顯著提高正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)(P<0.05);與對(duì)照組比,CTX致免疫抑制模型組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均極顯著降低(P<0.01),而灌胃低、高劑量的APS均可顯著提高CTX致免疫抑制小鼠的吞噬百分率及吞噬指數(shù)(P<0.05)。
表1 黃芪多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)及巨噬細(xì)胞功能的影響()Tab.1 The effect of astragalus polysaccharide on the thymus,spleen and macrophage phagocytosis indexes in mice
表1 黃芪多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)及巨噬細(xì)胞功能的影響()Tab.1 The effect of astragalus polysaccharide on the thymus,spleen and macrophage phagocytosis indexes in mice
注:*表示與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05);**表示與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01);△表示與環(huán)磷酰胺組相比差異有顯著性(P<0.05);△△表示與環(huán)磷酰胺組相比差異有顯著性(P<0.01)。Note.*P<0.05 indicates significant and**P<0.01 indicates extremely significant differences compared with the control group.△P<0.05 indicates significant and△△P<0.01 indicates extremely significant differences compared with the CTX model group.
組別Immuneorgan index免疫器官指數(shù)/mg吞噬指數(shù)Phagocytic index對(duì)照組 Control 5.29±0.25 1.94±0.03 26.42±2.69 1.83±0.19黃芪多糖低劑量組 Low dose APS group 5.53±0.12 2.21±0.18** 30.79±3.16* 1.91±0.28*黃芪多糖高劑量組 High dose APS group 5.88±0.14* 2.26±0.12** 33.62±2.42* 1.98±0.22*環(huán)磷酰胺組 Model group induced by CTX 3.91±0.34** 1.42±0.17** 16.39±3.20** 1.25±0.16**CTX+黃芪多糖低劑量組 CTX+low dose APS 4.41±0.26△ 1.57±0.25△ 21.86±2.15△ 1.59±0.31△CTX+黃芪多糖高劑量組 CTX+high dose APS 5.13±0.04△△ 1.76±0.04△△ 25.32±2.38△ 1.57±0.23 Groups巨噬細(xì)胞功能Macrophage phagocytosis脾臟指數(shù)Spleen index胸腺指數(shù)Thymus index吞噬百分率/%Phagocytic percentage△
注:A.空白對(duì)照組;B.黃芪多糖低劑量組;C.黃芪多糖高劑量組;D.CTX組;E.CTX+APS低劑量組;F.CTX+APS高劑量組。圖1 黃芪多糖對(duì)小鼠脾臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響Note.A.Blank control group;B.Low dose APS group;C.High dose APS group;D.CTX group;E.CTX+low dose APS group;F.CTX+high dose APS groupFig.1 Effects of different doses of APS on histological structure of the mouse spleens
注:A.空白對(duì)照組;B.黃芪多糖低劑量組;C.黃芪多糖高劑量組;D.CTX組;E.CTX+APS低劑量組;F.CTX+APS高劑量組。圖2 黃芪多糖對(duì)小鼠胸腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響Note.A.Blank control group;B.Low dosage APS group;C.High dosage APS group;D.CTX group;E.CTX+low dosage APS group;F.CTX+high dosage APS group.Fig.2 Effects of differerct doses of APS on histological structure of the mice spleens
如表2所示,與對(duì)照組相比,低、高劑量的APS可不同程度地提高小鼠 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值、降低CD8+百分含量(P<0.05或P<0.01);而 CTX 組 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+明顯降低,說明造模成功。與CTX組相比,低、高劑量的APS均可顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)提高免疫抑制小鼠外周血血清中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值(P<0.05或P<0.01),降低 CD8+百分含量。
表2 黃芪多糖對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響(,%)Tab.2 Influence of PCP on T lymphocytes subsets in peripheral blood of the immunosuppressed mice
表2 黃芪多糖對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響(,%)Tab.2 Influence of PCP on T lymphocytes subsets in peripheral blood of the immunosuppressed mice
注:*表示與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05),**表示與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01);△表示與環(huán)磷酰胺組相比差異有顯著性(P<0.05),△△表示與環(huán)磷酰胺組相比差異有顯著性(P<0.01)。Note.*Difference is significant(P< 0.05)and**difference is extremely significant(P< 0.01)in comparison with the control;△Difference is significant(P<0.05)and△△difference is extremely significant(P<0.01)compared with CTX model group.
組別 Groups CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+對(duì)照組 Control 32.16±1.91 26.24±0.92 16.75±1.71 1.53±0.21黃芪多糖低劑量組 APS 1group 34.91±3.02* 28.01±1.98* 14.87±1.59* 1.92±0.43*黃芪多糖高劑量組 APS 2 group 35.27±2.76* 29.12±2.14* 13.24±0.91** 2.32±0.25**環(huán)磷酰胺模型組The model group 20.36±2.13** 17.53±1.21** 21.23±1.47** 1.07±0.13**CTX+PCP中濃度CTX+APS1 27.52±1.87△ 21.28±3.15△ 19.52±0.79△ 1.38±0.14 CTX+黃芪多糖組CTX+APS2 30.89±3.71△△ 23.75±1.87△ 17.92±1.28△△ 1.47±0.23△
脾臟、胸腺指數(shù)在一定程度上能反應(yīng)出免疫器官的發(fā)育程度,可以直觀的體現(xiàn)出機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。較多研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí),植物多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑能夠促進(jìn)免疫器官的發(fā)育成熟,延緩胸腺退化。Liu等[5]的研究證實(shí),雞爪大黃多糖可以明顯提高輻射誘導(dǎo)免疫損傷小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)、碳廓清率、巨噬細(xì)胞吞噬活性、淋巴細(xì)胞增值率及血清溶血素值及NK活性,提示雞爪大黃多糖對(duì)輻射誘導(dǎo)的小鼠免疫損傷具有保護(hù)作用。衰老小鼠給以白術(shù)多糖提取物后其胸腺、脾臟和心臟指數(shù)均顯著增加,提示白術(shù)多糖提取物可能增強(qiáng)衰老小鼠的免疫并促進(jìn)其心臟功能[6]。雞樅菌多糖能明顯拮抗CTX的細(xì)胞毒作用,促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,提高免疫抑制小鼠的脾臟和胸腺重量及器官指數(shù),對(duì)免疫器官有明顯保護(hù)作用[7]。150 mg/kg黃芪多糖灌胃小鼠7d可顯著小鼠胸腺和脾臟重量[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低、高劑量的APS均可顯著提高正常小鼠及免疫抑制小鼠的脾臟及胸腺器官指數(shù),表明PCP可以促進(jìn)小鼠免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能障礙有一定的改善,且其促進(jìn)作用與劑量呈正相關(guān)。
免疫器官的組織發(fā)育程度也直接影響到其生理功能,較多的研究已經(jīng)證實(shí),某些中藥成分可以在一定程度上促進(jìn)動(dòng)物免疫器官的組織發(fā)育。周金星等[9]研究了不同劑量黨參和淫羊藿提取物對(duì)青腳麻雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明飲水中添加黨參和淫羊藿提取物均可促進(jìn)青腳麻雞脾臟的組織發(fā)育。喬恩美等[10]的研究結(jié)果顯示,基礎(chǔ)日糧中添加20和40 mg/kg低聚殼聚糖能明顯促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)性能及免疫器官的組織發(fā)育,增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低、高劑量APS組小鼠脾臟白髓面積增大,脾小結(jié)生發(fā)中心明顯,動(dòng)脈周圍淋巴鞘增厚;胸腺小葉體積增大,皮質(zhì)變厚,高劑量PCP組效果更為明顯。CTX致免疫抑制小鼠在灌服不同劑量的APS后,脾臟及胸腺組織形態(tài)均有所改善,提示APS可以拮抗CTX引起的小鼠脾臟和胸腺發(fā)育損傷,提高免疫抑制小鼠脾臟及胸腺的免疫功能。
巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要作用。因而,激活巨噬細(xì)胞可提高機(jī)體抗腫瘤和抗感染能力[11]。腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能還是機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答的重要組成部分。已經(jīng)證實(shí),植物多糖可激活巨噬細(xì)胞,提高其吞噬功能。如馬齒覓多糖可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能,增加吞噬百分率和吞噬指數(shù),促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[12]。曾星等[13]用流式細(xì)胞術(shù)研究了豬苓多糖對(duì)模型大鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的影響,結(jié)果表明,豬苓多糖可顯著促進(jìn)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能和表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,CTX組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著降低,低、高劑量APS組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比均顯著升高。添加低、高劑量的APS均顯著提高了免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù),說明APS在一定程度上可促進(jìn)小鼠的非特異性免疫功能。
T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志有兩大類:一類為T淋巴細(xì)胞所共有的CD3+標(biāo)志,另一類為亞群特有標(biāo)志,CD4+為輔助/誘導(dǎo)功能細(xì)胞,CD8+為抑制/殺傷功能細(xì)胞。有研究證實(shí),T淋巴細(xì)胞對(duì)體內(nèi)一切體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)類型和強(qiáng)度都有調(diào)節(jié)作用,其中主要的是CD3、CD4、CD8細(xì)胞亞群。CD3+亞群是成熟的T淋巴細(xì)胞,其比值降低提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能減弱,機(jī)體易發(fā)生感染;CD4+亞群是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最重要的樞紐細(xì)胞,其值降低會(huì)引起機(jī)體免疫功能低下;CD8+亞群為免疫反應(yīng)中的直接殺傷性細(xì)胞,其值增高可導(dǎo)致免疫缺陷;CD4+/CD8+比值,判斷機(jī)體免疫功能紊亂的臨床診斷敏感指標(biāo),其值降低提示機(jī)體處于“免疫抑制”狀態(tài)[14]。有研究[15-16]證實(shí),黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)、板藍(lán)根多糖(isatis root polysaccharide,IRPS)、牛膝多糖(achyranthes root polysaccharide,ARPS)和山藥多糖(Chinese yam polysaccharide,CYPS)均能顯著提高免疫雛雞的新城疫HI抗體效價(jià),促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞增殖,并可提高CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞含量和CD4+/CD8+值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中、高劑量的APS均可不同程度提高正常及免疫抑制小鼠外周血血清中 CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值(P<0.05或P<0.01),而降低CD8+百分含量,提示黃芪多糖可以明顯促進(jìn)免疫抑制小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖,增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫,從而改善機(jī)體的免疫功能低下狀態(tài)。
結(jié)合本文與已有文獻(xiàn)報(bào)道可以看出黃芪多糖干預(yù)正常小鼠和免疫抑制小鼠后,其相應(yīng)的免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能和外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD8+百分含量等均呈現(xiàn)了顯著性的變化,且與其他多糖的免疫調(diào)控機(jī)制有相似之處,闡明了黃芪多糖的免疫調(diào)控作用機(jī)制。因此,從本文研究指標(biāo)的敏感性變化規(guī)律看,本文研究結(jié)果與評(píng)價(jià)體系可以作為評(píng)價(jià)多糖類類物質(zhì)對(duì)機(jī)體免疫調(diào)控的的參考標(biāo)準(zhǔn)與指導(dǎo)。
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